Despigmentação e Prestação do Rim de Peixe-Zebra: Uma Técnica para Preparar o Rim de Peixe-Zebra Adulto para Coloração

Resumo

Fonte: McCampbell, K. K. et al. Análise da composição e função do néfron no rim do peixe-zebra adulto. J. Vis. Exp. (2014)

Neste vídeo, demonstramos a despigmentação do rim de peixe-zebra adulto e sua posterior preparação para procedimentos de coloração. Após a coloração, o rim de peixe-zebra adulto pode ser usado para estudar a regeneração renal, caracterização fenotípica de modelos de doença renal e funcionalidade do néfron.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Fixação, dissecção, permeabilização e remoção da pigmentação do rim de peixe-zebra adulto

1. Prepare uma solução fixadora fresca de paraformaldeído (PFA) a 4% / 1X PBS / 0,1% de DMSO ou descongele uma alíquota congelada de 4% de PFA / 1X PBS e adicione 0,1% de DMSO.
   CUIDADO: O PFA é tóxico e as soluções de PFA devem ser manuseadas com capuz químico usando equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas e jaleco. Além disso, o pó de PFA deve ser manuseado com cuidado ao fazer a solução estoque.
2. Encha uma bandeja de dissecação com solução fixadora suficiente para submergir todo o animal.
3. Eutanásia e montagem do peixe-zebra selecionado em solução de fixação.
   nota: O peixe selecionado pode ser um espécime de rim de peixe-zebra não tratado ou um rim isolado de um peixe-zebra que recebeu anteriormente uma injeção intraperitoneal de dextrano.
4. Fixe o O/N da amostra (12–16 horas) a 4 ^oC.
5. No dia seguinte, use uma pinça fina para separar cuidadosamente o rim da parede dorsal do corpo e coloque o órgão em um frasco de vidro usando uma pipeta de transferência.
   NOTA: Alternativamente, um prato de cultura de 12 ou 24 poços pode ser usado. Enquanto um tubo de microcentrífuga de plástico pode ser usado, os tubos de tamanho padrão (1,5 mL) podem restringir a lavagem.
6. Lave o rim dissecado 3 vezes com 3-5 mL de 1X PBS com 0,05% Tween por 5 min cada.
7. Remova o 1X PBS com 0,05% Tween e enxágue o rim com 3 mL de uma solução de sacarose a 5% (em 1X PBS) por 30 min.
8. Substitua por 3 mL de solução de sacarose a 30% (em 1X PBS) e armazene O/N (12–16 horas) a 4 ^oC.
   NOTA: As soluções de sacarose permeabilizam as membranas celulares, permitindo posteriormente a marcação específica dos reagentes à medida que penetram no tecido.
9. No dia seguinte, remova a solução de sacarose a 30% e lave o rim 2 vezes com 5 mL de PBS 1X com Tween a 0,05% por 5 min cada.
10. Substitua o PBS 1X por Tween 0,05% com 3-5 mL de solução clareadora para remover a pigmentação dos melanócitos presente no órgão renal.
11. Coloque o frasco de vidro em um rotador e observe cuidadosamente como a pigmentação desaparece.
    NOTA: A despigmentação normalmente leva aproximadamente 20 minutos quando realizada após o tratamento com sacarose, mas ocasionalmente pode levar até 60 minutos. Se a solução clareadora for deixada no rim por muito tempo, pode ocorrer desintegração do órgão; É aconselhável monitorar a amostra a cada 10 a 15 minutos para verificar a integridade do tecido.
12. Quando a pigmentação tiver sido removida do rim, lave duas vezes com 3-5 mL de 1X PBS com 0,05% de Tween.
13. Substitua o PBS 1X por Tween a 0,05% por 3–5 mL de solução de PFA a 4% por 1 hora em RT.
14. Remova a solução de PFA a 4% e lave o rim 3 vezes com 3–5 mL de PBS 1X com Tween a 0,05% por 5 min cada.
    NOTA: Uma vez concluída a fixação, o rim também pode ser montado em uma lâmina de vidro e avaliado quanto à captação de dextrana sem a pigmentação dos melanócitos.
15. Remova o PBS 1X com 0,05% de Tween e substitua por 3-5 mL de solução de bloqueio e, em seguida, incube o rim em RT no bloco por 2 horas.
16. Quando o bloqueio estiver concluído, prossiga diretamente para o protocolo de coloração selecionado.
    NOTA: O rim agora pode ser processado por meio de um ou mais outros procedimentos para realizar estudos de marcação com diferentes reagentes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1X PBS			Feito diluindo 10X PBS em água destilada
1X PBST			0,1% de detergente Tween-20 em 1X PBS
1X PBS com interpolação de 0,05%			0,05% de detergente Tween-20 em 1X PBS
Pré-adolescente 20	Bioanalítica Americana	AB02038
4% PFA/1X PBS			Dissolva 4% de PFA (p / v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) em 1X PBS, leve para ferver em uma placa quente em uma capela de exaustão. Arrefecer e congelar as alíquotas para armazenamento no congelador a -20°C. Descongelar imediatamente antes de utilizar e não voltar a congelar as calhas
Solução de branqueamento			Fórmula de mistura de alvejante (para uma solução de 20 ml): 1,6 ml de solução de hidróxido de potássio a 10% 0,6 ml de solução de peróxido de hidrogênio a 30% 100 μl de Tween a 20% Encha até 20 ml com água destilada
Hidróxido de potássio	sigma	221473
Peróxido de hidrogénio	sigma	H1009
Solução de bloqueio			Solução de bloqueio (para uma solução de 10 ml): 8 ml de 1X PBS com 0,05% Tween 2 ml de soro fetal de bezerro 150 μl de DMSO