Patologia de expansão: um método para imagens ópticas de alta resolução de amostras de tecido clínico

Resumo

Fonte: Klimas, A. et al. Imagem nanoscópica de seções de tecido humano por meio de expansão física e isotrópica.J. Vis. Exp.(2019)

Neste vídeo, descrevemos um método chamado patologia de expansão, uma variante da microscopia de expansão, em que as amostras de tecido clínico são expandidas quimicamente usando uma rede de polímeros para exame microscópico de estruturas em nanoescala.

Protocolo

1. Polimerização in situ de amostras

1. Incubar o corpo de prova em uma solução de ancoragem.
   1. Prepare a solução de ancoragem (normalmente 250 μL é suficiente para cobrir a seção do tecido) diluindo a solução estoque de AcX em 1x PBS a uma concentração de 0,03 mg / mL para amostras fixadas com fixadores não aldeídos ou 0,1 mg / mL para amostras fixadas com fixadores de aldeído, que têm menos aminas livres disponíveis para reagir com AcX.
   2. Colocar a lâmina numa placa de Petri de 100 mm e pipetar a solução de ancoragem sobre o tecido. Incubar durante pelo menos 3 h em RT ou durante a noite a 4 °C.
2. Incubar as amostras em solução gelificante.
   1. Prepare pelo menos 100 vezes o excesso de volume de solução gelificante. Por 200 μL, combine o seguinte, em ordem: 188 μL de solução monômero, 4 μL de solução estoque 4HT a 0,5% (diluição 1:50, concentração final: 0,01%), 4 μL de solução estoque TEMED a 10% (diluição 1:50, concentração final 0,2%) e 4 μL de solução estoque APS a 10% (diluição 1:50, concentração final 0,2%).
      NOTA: A solução gelificante deve ser feita imediatamente antes do uso. A solução deve ser mantida a 4 °C e a solução APS deve ser adicionada por último, para evitar a gelificação prematura.
   2. Retirar o excesso de solução da secção de tecido e colocar a lâmina numa placa de Petri de 100 mm. Adicione a solução gelificante fresca e fria à amostra e incube a mistura no tecido por 30 min a 4 °C, para permitir a difusão da solução no tecido.
3. Construa uma câmara na lâmina ao redor da amostra (Figura 1A) sem perturbar a solução gelificante.
   1. Faça espaçadores para a câmara de gelificação cortando pedaços finos de vidro de cobertura usando uma faca de diamante.
      NOTA: Para facilitar a imagem pós-expansão, os espaçadores devem ter espessura próxima à amostra de tecido para reduzir a quantidade de gel em branco acima do tecido. O vidro número 1,5 pode ser usado para amostras clínicas padrão (5−10 μm). As peças de vidro de cobertura podem ser empilhadas para amostras mais espessas.
   2. Prenda os espaçadores em ambos os lados do tecido usando gotículas de água (~ 10 μL).
   3. Coloque cuidadosamente uma tampa de vidro de cobertura sobre a lâmina, certificando-se de evitar prender bolhas de ar sobre o tecido (Figura 1B).
4. Incubar a amostra a 37 °C em um ambiente umidificado (como uma placa de Petri fechada com um pano úmido) por 2 h.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. A câmara deslizante pode ser armazenada dentro de uma placa de Petri selada a 4 °C.

2. Digestão da amostra

1. Remova a tampa da câmara de gelificação deslizando suavemente uma lâmina de barbear sob a lamínula e levantando lentamente a lamínula da superfície do gel. Apare o gel em branco ao redor do tecido para minimizar o volume. Corte o gel assimetricamente para rastrear a orientação do gel após a homogeneização, pois a amostra ficará transparente.
   1. Diluir ProK a 1:200 em tampão de digestão (concentração final de 4 U/ml) antes de utilizar. Prepare solução suficiente para submergir completamente o gel; um único poço de uma placa de cultura de células plásticas de quatro poços requer pelo menos 3 mL por poço.
   2. Incubar a amostra num recipiente fechado contendo o tampão de digestão durante 3 h a 60 °C. Se a amostra não se soltar da lâmina durante a digestão, use uma lâmina de barbear para remover suavemente a amostra.
      NOTA: A amostra deve ser completamente submersa em tampão de digestão para evitar que a amostra seque e colocada em um recipiente coberto (pequena caixa de lâminas, poço de plástico, placa de Petri, etc.) que pode ser selado com filme.

3. Expansão e imagem da amostra

1. Use um pincel macio para transferir a amostra para 1x PBS em um recipiente compatível com o sistema de imagem desejado e grande o suficiente para acomodar o gel totalmente expandido. Certifique-se de que o tecido seja colocado com o lado da amostra voltado para baixo se a imagem for em um sistema invertido ou para cima se a imagem for feita em um sistema vertical para minimizar a distância da objetiva de imagem à amostra. Vire o gel usando um pincel macio, se necessário.
   nota: A iluminação lateral de um LED pode ser usada para torná-los visíveis em líquido. Uma placa padrão de 6 poços pode acomodar amostras com diâmetro pré-expandido inferior a 0,6 cm. Uma placa de poço com fundo de vidro deve ser usada para imagens em um sistema invertido.
2. Lave as amostras em 1x PBS em RT por 10 min. Se desejar, core novamente a amostra com DAPI 300 nM enquanto o processo de digestão lava a mancha DAPI. Remova o PBS e manche com 300 nM DAPI diluído em 1x PBS por 20 min em RT, seguido de uma lavagem de 10 min com 1x PBS em RT.
   NOTA: As amostras podem ser cobertas com 1x PBS e armazenadas a 4 °C antes de prosseguir para a próxima etapa.
3. Para expandir as amostras, substitua o PBS e lave com um volume excessivo de ddH₂O (pelo menos 10x o volume final do gel) 3−5 vezes por 10 min cada, em RT.
   nota: Após a^3ª ou^4ª lavagem, a expansão da amostra deve começar a se estabilizar. Para armazenamento, para evitar o crescimento bacteriano, o ddH₂O pode ser suplementado com 0,002% a 0,01% de azida sódica (NaN₃). Nesse caso, o fator de expansão final é reversivelmente reduzido em 10%.
4. Realize imagens de fluorescência usando um microscópio convencional de campo amplo, microscópio confocal ou outro sistema de imagem de sua escolha.
   nota: Para evitar que os géis se espalhem, o excesso de líquido pode ser removido do poço. Os géis também podem ser imobilizados com agarose de baixo ponto de fusão a 1,5 a 2%. Prepare agarose de baixo ponto de fusão a 1,5 a 2% (p / v) em água em um recipiente 2 a 4 vezes o volume da solução. Aqueça a solução em banho-maria a 40 °C ou no micro-ondas por 10 a 20 segundos para derreter a solução. Pipete a agarose derretida ao redor das bordas do gel. Depois de deixar a agarose endurecer a RT ou 4 °C, adicione água à amostra para evitar a desidratação.

Resultados

Figura 1: Câmara de gelificação para amostras de patologia. (A) Dois espaçadores, como dois pedaços de vidro de cobertura # 1,5 cortados com uma faca de diamante, são colocados em ambos os lados do tecido após incubar a amostra em solução gelificante a 4 ° C. Os espaçadores devem ser mais grossos do que as fatias de tecido, para evitar a compressão da amostra. (

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de fundo de vidro de 6 poços (# 1,5 lamínula)	Cellvis	P06-1.5H-N
acetona	Fischer Scientifc	Rolamento A18-500
acrilamida	Sigma Aldrich	Rolamento A8887
Acriloil-X SE, (AcX)	Invitrogen	A20770
agarose	Fischer Scientifc	BP160-100
Persulfato de amônio (APS)	Sigma Aldrich	Resposta 3678	Iniciador
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Científico	Nº 62248	Mancha nuclear
Faca diamantada nº 88 CM	Ferramentas Gerais	31116
etanol	Pharmco	111000200
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 M	VWR	BDH7830-1
Amostra de rim FFPE	USBiomax	HuFPT072
fórceps
Micro vidro de cobertura #1 (24 mm x 60 mm)	VWR	Nº 48393 106
Micro tampa de vidro #1,5 (24 mm x 60 mm)	VWR	Nº 48393 251
N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	acelerador
N,N′-metilenobisacrilamida	Sigma Aldrich	M7279
Nunclon Placa de Cultura de Células de 6 Poços	Thermo Fisher	140675
Nunc 15 mL Cônico	Thermo Fisher	339651
Nunc 50 mL Cônico	Thermo Fisher	339653
Agitador Orbital
Pincel
Medidor de pH
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 10x	Fischer Scientifc	BP399-1
Placa de Petri de plástico (100 mm)	Fischer Scientifc	FB0875713
Proteinase K (Grau de Biologia Molecular)	Thermo Científico	EO0491
Lâmina	Fischer Scientifc	12640
Tubos de microcentrífuga Safelock 1,5 mL	Thermo Fisher	3457
Tubos de microcentrífuga Safelock 2,0 mL	Thermo Fisher	3459
Acrilato de sódio	Sigma Aldrich	Nº 408220
cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S6191
Citrato de sódio tribásico di-hidratado	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Base Tris	Fischer Scientifc	BP152-1
Tritão X-100	Sigma Aldrich	T8787
xileno	Sigma Aldrich	214736