Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Acesso de pipeta lateral ao rim abaixo de uma coluna de imagem de fluido por meio de um novo procedimento cirúrgico
NOTA: A montagem do sistema de suporte de imagem e preparação cirúrgica é mostrada na Figura 1. O procedimento descrito é realizado em camundongos C57BL / 6 pesando 20–25 g.
- Pese o mouse.
- Induza a anestesia com isoflurano a 4% e mantenha com isoflurano a 1,5–2,5% na mistura ar/oxigênio. Confirme se o camundongo está anestesiado pela ausência de resposta ao estímulo doloroso e frequência respiratória reduzida.
- Lubrifique os olhos e posicione o animal lateralmente em uma placa de base. Imobilize 4 extremidades usando fita adesiva.
- Injete solução salina normal, 200 μL, por via subcutânea e coloque uma sonda de temperatura retal. Controle a temperatura usando uma lâmpada de aquecimento durante a cirurgia e uma almofada de aquecimento durante a imagem.
- Remova todos os pelos do lado esquerdo do mouse usando um creme depilatório.
- Localize o baço, que é visível sob a pele, e localize o rim esquerdo no lado dorsal e caudal do baço.
- Faça uma incisão de 0,5 cm na pele e uma incisão menor no peritônio, apenas o suficiente para que o rim passe facilmente.
- Faça a extrusão do rim com uma leve pressão. Coloque a forma de estabilizador renal feita com polissiloxano ao redor do rim e fixe com adesivo de cianoacrilato. Alinhe o rim com o espaçador de modo que a superfície mais lateral do rim se estenda além do estabilizador em cerca de 1 mm.
- Fixe uma placa de cabeça na forma do estabilizador com cola e monte a placa de cabeça nas barras de montagem na placa de base.
- Encha o poço no suporte de polissiloxano ao redor do rim com solução de agarose a 1% e coloque a lamínula de 10 mm por cima e segure até que a agarose esteja firme. Sele a lamínula na placa da cabeça com cola e crie um anel ao redor da lamínula com cimento dental.
- Injete FITC-dextrano (2.000.000 Da, solução a 5%, 100–150 μL) retroorbitalmente e mova o mouse e a placa de fixação para o estágio do microscópio de 2 fótons rapidamente, mantendo a anestesia e garantindo a eliminação adequada de gases residuais no estágio do microscópio.
2. Seleção de um glomérulo adequado e pipeta Acesso ao espaço de Bowman
- Definições:
- Defina X como esquerda-direita na tela e esquerda-direita voltada para o microscópio
- Leia SX (stage X) do stage controlador
- Defina PX como pipeta X, no controlador de discagem de pipeta
- Defina Y como de cima para baixo na tela e para frente em direção ao microscópio e de volta para a configuração de 2 fótons
- Defina Z como para cima em direção ao teto, para baixo em direção ao chão e medido no palco com a posição Z da objetiva.
- Defina S(O)Z como a altura do palco (na verdade, o objetivo).
- Encontre a superfície do rim, identificável usando as configurações do filtro de proteína fluorescente verde (GFP) na ocular. Devido à injeção de FITC-Dextran, a vasculatura ficará verde brilhante.
- Identifique um glomérulo adequado. Depois de identificar a superfície do rim usando a ocular, mude para 2 fótons (modo sem varredura) e explore a janela de imagem. As características favoráveis para a micropuntura são as seguintes: distância vertical abaixo da lamínula >30 μm (para evitar colisão entre a pipeta e a lamínula durante o acesso) e distância lateral da cápsula renal lateral ao glomérulo <400 μm (além dessa distância, o desvio da pipeta pode aumentar a probabilidade de erro).
- Registre a distância lateral e vertical até o ponto de punção, um ponto na cápsula renal diretamente ao lado da pipeta do glomérulo.
- Eleve o ponto focal da objetiva na coluna d'água, mantendo as coordenadas do estágio x e y inalteradas, apenas cerca de um centímetro.
- Insira a ponta da pipeta na coluna de água e ligue a excitação de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Mova a pipeta nas dimensões x e y até o ponto de fluorescência máxima da ponta, este será o centro da objetiva. Encontrar a pipeta na ocular é difícil sem esse pré-posicionamento preciso. Como os pontos quânticos fluorescem no mesmo comprimento de onda (neste caso, vermelho), independentemente do comprimento de onda de excitação, a excitação DAPI produz fluorescência vermelha, que é fortemente focada na ponta, ilustrada na Figura 2.
- Altere a configuração de excitação para proteína fluorescente vermelha (RFP) e visualize a pipeta na ocular e, em seguida, centralize-a com precisão na visualização ocular.
- Mude para 2 fótons e encontre a pipeta em 2 fótons, colocando-a precisamente no centro da imagem. Esta é a posição de registro.
- Salve uma imagem da pipeta.
- Registre as coordenadas do estágio e do controlador de micropipetas.
nota: Use o arquivo de .html suplementar, que executará cálculos usando código JavaScript (vantajoso em sistemas que não possuem software de planilha instalado) ou uma planilha para calcular o deslocamento entre as coordenadas do estágio e da pipeta e para calcular as coordenadas alvo para o controlador de pipeta.
- Remova a pipeta da coluna de água no eixo x, mantendo z e y iguais.
- Mova a pipeta Z para o glomérulo alvo Z (ou seja, mova a pipeta para baixo na direção Z abaixo da lamínula)
- Mova a pipeta Y para a coordenada do glomérulo Y alvo.
- Mova a visualização ao vivo de 2 fótons para o glomérulo Z alvo e, em seguida, para a borda do rim e observe o SX.
- Calcule a borda do rim PX usando o deslocamento do registro SX.
- Mova o stage em direção à pipeta (aumente o SX) de forma que a borda do rim fique bem à esquerda da tela, mas ainda visível.
- Avance a pipeta rapidamente para cerca de 100 μm a menos do que a borda do rim PX calculada acima.
- Localize a ponta da pipeta, avançando a pipeta lentamente. Aumente o ganho de vermelho e observe o histograma de pixel vermelho (a distribuição de pixels muda antes que a pipeta seja visualizada na janela, devido ao brilho extremo dos pontos quânticos e à fluorescência fora do alvo).
- Avance para a borda do rim sob imagens de 2 fótons ao vivo.
nota: Antes de entrar na cápsula renal, é possível redirecionar a pipeta nas dimensões Y e Z. No entanto, isso pode quebrar a ponta da pipeta. Uma medida mais conservadora, se a pipeta estiver fora do alvo, é retirar na dimensão X até 2 cm, redirecionar e depois retornar na dimensão X para a borda do rim. Uma vez que a pipeta está dentro do tecido, o movimento em qualquer eixo diferente de X leva à flexão da pipeta, que requer grande experiência para ser usada e freqüentemente leva à quebra.
- Conduza a pipeta no eixo X lentamente até o PX alvo glom, mantendo um olho no SX. (É útil voltar ocasionalmente ao glomérulo para ver se ele se deslocou após a inserção da micropipeta).
- Quando estiver no local correto, documente a posição com uma pilha z.
nota: Com a micropipeta no lugar, drogas, proteínas ou traçadores fluorescentes podem ser injetados, o fluido pode ser aspirado para análise posterior ou a pressão ou carga em relação a outro eletrodo pode ser medida.
3. Aspiração de Fluido do Espaço de Bowman
- Defina a microbomba para injetar 100 nL de perfluorodecalina durante 2 min para garantir a permeabilidade da pipeta e reduzir a confusão do entupimento da pipeta durante a entrada. Recrie a imagem para garantir a posição da pipeta.
- Aguarde 4–6 min para filtragem adicional.
- Defina a microbomba para aspirar até 300 nL a uma taxa de até 50 nL/min.
nota: Alterações na morfologia glomerular não são observadas com essa taxa, sugerindo que ela não altera a taxa de entrega de líquido ao espaço durante a aspiração. Como não há bloco de óleo como na micropuntura convencional, a recuperação desse volume, necessária para a espectrometria de massas, pode incluir parte da perflourodecalina injetada e possivelmente fluido tubular. Para ensaios como medições de eletrodos sensíveis a íons, espectroscopia de fluorescência, reação em cadeia da polimerase e outros pontos finais sensíveis, volumes menores podem ser usados. Se a espectrometria de massa não for o ponto final, óleo mineral e técnicas padrão de micropuntura podem ser usadas para medir o volume aspirado antes do armazenamento.
- Imagem mais uma vez.
- Retirar a pipeta e conservar a amostra, adicionando tampão TRIS e armazenando a -80° antes da análise.
- Eutanasiar o camundongo usando uma overdose de isoflurano ou outro método aprovado.
nota: O filtrado entra no espaço por filtração dos capilares glomerulares. A taxa de filtração glomerular de néfron único (SNGFR) em camundongos é relatada entre 8–14 nL/min. As forças de Starling governam o SNGFR, no entanto, e a pressão hidrostática negativa no espaço de Bowman, portanto, pode aumentar o SNGFR. Os métodos padrão de micropuntura usam bloqueio tubular com óleo e pressão neutra para amostragem de fluido tubular, no entanto, esses compostos interferem na espectrometria de massa (veja abaixo); portanto, nesta técnica, o túbulo proximal inicial permanece patente. Além disso, no momento da aspiração, o espaço de Bowman contém um volume desconhecido, mas positivo, de filtrado. Portanto, a taxa de aspiração de fluidos pode exceder SNGFR.
nota: Nos experimentos aqui descritos, o objetivo foi obter uma amostra maior do que o usual de filtrado glomerular para análise por espectrometria de massas por técnicas nanoproteômicas. Uma vez que a utilização da espectrometria de massa impede a utilização de blocos de óleo com óleo mineral ou cera (misturas complexas de moléculas orgânicas que reduzem o sinal: ruído na espectrometria de massa), utiliza-se perfluorodecalina para encher a micropipeta e a seringa. A perflourodecalina não é conhecida por bloquear o fluxo tubular, mas é biologicamente inerte e não interfere na espectrometria de massa.
