Cultura organotípica renal em CAM de galinha: uma técnica para transplante de explantes renais murinos em CAM de galinha para induzir a formação de arquitetura vascular renal

Resumo

Fonte: Kaisto, S. et al. Otimização de Cultura Organoide e Organotípica Renal para Vascularização, Desenvolvimento Estendido e Imagem de Microscopia Aprimorada. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo descreve um método para estudar o desenvolvimento de órgãos usando uma configuração aprimorada de xenotransplante na membrana corioalantóide (CAM) de embriões de aves. Este método permite o desenvolvimento de órgãos embrionários e organoides cultivados totalmente vascularizados.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE

1. Fabricação de minireservatórios para cultivo de rins embrionários de camundongos e organoides renais em CAM de galinha e configuração de experimentos de xenotransplante

1. Use insertos de cultura de células transwell projetados para placas de 6 ou 12 poços.
   nota: Dependendo do experimento específico, minireservatórios grandes ou pequenos podem ser usados. É melhor usar pequenos minireservatórios para xenoenxerto de até oito rins embrionários ou quando vários minireservatórios forem colocados no mesmo embrião de galinha (por exemplo, amostras experimentais e de controle no mesmo CAM de galinha).
2. Corte as laterais das pastilhas usando uma multiferramenta rotativa com uma lâmina de serra circular ou uma serra manual para criar um anel de plástico de 2 mm de altura com uma membrana permeável presa a ele.
3. Polir as bordas desses minireservatórios com um bisturi ou uma faca afiada.
4. Esterilize os minireservatórios em etanol a 70% por pelo menos 1 h.
5. Lave os minireservatórios em água bidestilada autoclavada e deixe-os secar em uma coifa laminar.
6. Enxágue os minireservatórios em PBS e meio de cultura (DMEM com alto teor de glicose / 10% FBS / 1% de penicilina-estreptomicina).
7. Colocar o reservatório numa placa de Petri, sobre uma gota (600 μL/400 μL) de meio de cultura com a membrana virada para cima.
8. Disponha os rins embrionários ex vivo dissecados ou organoides renais uniformemente na membrana com a ajuda de uma pipeta ou de um tubo capilar de vidro. Evite deixar muito líquido ao redor dos rins.
9. Deixe as amostras se ligarem à membrana por 2 a 24 h em uma incubadora de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO₂.
   nota: Até oito rins embrionários de camundongos E11.5 ou organoides renais podem ser dispostos na pequena inserção. A inserção grande é recomendada se pedaços maiores de tecido embrionário forem usados para xenotransplante ou uma mistura de hidrogel celular em uma área maior do CAM.
10. Retire da incubadora de cultura de células galinhas embrionárias cultivadas ex ovo com 8 dias de idade, preparadas de acordo com métodos publicados anteriormente,
11. Transfira os minireservatórios para o CAM de modo que os enxertos fiquem voltados para o CAM e a membrana os sobreponha. Coloque os minireservatórios na periferia do CAM para que não cubram o embrião de galinha.
    nota: Ao usar os minireservatórios menores fabricados a partir de insertos transwell para placas de 12 poços, até três minireservatórios podem ser colocados em um CAM.
12. Adicione 500 μL (inserto de 6 poços) ou 300 μL (inserto de 12 poços) de meio de cultura aos minireservatórios.
13. Cultive as amostras em CAM de frango por no máximo 9 dias. Substituir diariamente o meio de cultura nos minireservatórios.
    nota: A vascularização das amostras pode ser observada 24 a 48 horas após o transplante.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incubadora de células	Panasonic	13090543	Temperatura ajustada a 37° C, 90% de umidade, 5% de CO₂
Incubadora de células	SANYO	10070347	Incubadora de cultura CAM de frango. Temperatura ajustada a 37° C, 90% de umidade, 5% de CO₂
Meio de Águia Modificado de Dulbecco	sigma	D777	Glicose alta
Etanol (70%)	VWR
Soro fetal bovino	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Fórceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Pbs-/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biooeste	X0520-500	Lavagem dos mini reservatórios.
Penicilina e estreptomicina	sigma	Pág. 4333
Inserções de cultura de células de 12 poços Thincert com membrana de poliestireno de poro de 0,4 μm	Greiner Bio-One	665641
Inserções de cultura de células de 6 poços Thincert com membrana de poliestireno de poro de 0,4 μm	Greiner Bio-One	Nº 657610