$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Prepare unidades estereotáxicas para cirurgia
- Ligue todas as máquinas de anestesia, balanças vernier digitais e injetores digitais.
nota: Todas as ferramentas cirúrgicas devem ser adequadamente limpas e esterilizadas antes da cirurgia.
- Utilize máquinas anestésicas com uma câmara de indução em uma cabine de segurança biológica (Figura 1A).
- Certifique-se de que todos os tubos das máquinas de anestesia estejam conectados às estruturas estereotáxicas (Figura 1B, inserção 1C) e clamps nos tubos estão abertos para todas as unidades que estão sendo usadas. Feche todos os grampos nos tubos que vão para armações estereotáxicas que não serão usadas para cirurgia.
- Defina as máquinas de anestesia para a taxa de fluxo do cone nasal recomendada pelo fabricante com base no peso do mouse (por exemplo, 25 g de peso do animal: taxa de fluxo do cone nasal 34 mL / min).
nota: O suporte de cabeça incluído nesta configuração estereotáxica é recomendado apenas para ratos adultos. Certifique-se de que as recomendações do fabricante incluídas na configuração estereotáxica sejam seguidas.
- Certifique-se de que o anestésico apropriado (por exemplo, isoflurano) pré-preenchido na seringa esteja conectado ao aparelho de anestesia (Figura 1B).
nota: O excesso de preparação da seringa pode causar muita anestesia aos camundongos durante a cirurgia e resultar em uma overdose de anestésico.
- Prepare as brocas girando a trava do estágio, inserindo um adaptador de broca e uma broca de 1 mm em cada broca e trave a broca apertando manualmente a trava da broca.
- Anexe brocas aos quadros estereotáxicos (Figura 1C).
2. Coloque os ratos em quadros estereotáxicos
- Anestesiar camundongos (por exemplo, isoflurano) usando a câmara de indução acima mencionada.
- Mantenha os camundongos durante todo o procedimento em um plano anestésico profundo. A % de anestesia administrada pela máquina depende de vários fatores, incluindo: taxa de fluxo, grau de estimulação e temperatura corporal. Monitore os camundongos frequentemente durante todo o procedimento quanto à profundidade da anestesia, avaliando as respirações rítmicas (o animal não está ofegante); ausência de reflexo palpebral (vibração das pálpebras quando estimulada com aplicador de ponta de algodão); e ausência de pinça do dedo do pé (retirada do membro ao estímulo nocivo de beliscar os dedos dos pés).
nota: Diferentes cepas de camundongos terão uma resposta diferente à anestesia.
- Depois que os camundongos estiverem em um plano anestésico profundo apropriado, transfira os camundongos para a unidade estereotáxica. Use uma almofada de aquecimento enquanto o mouse estiver na máquina estereotáxica para manter a temperatura corporal e um plano anestésico apropriado.
nota: Para obter um perfil baixo, usamos aquecedores de mãos ativados por ar colocados dentro de uma caixa de ponta de pipeta invertida (caixa de elevação do mouse na Figura 1D).
- Abra a boca do rato e coloque os dentes na calha da barra bucal localizada na peça do nariz na estrutura estereotáxica (Figura 2A). Deslize o cone do nariz sobre o nariz/boca do mouse (Figura 2B).
- Coloque os ratos com a cabeça nivelada na barra bucal. Abra suavemente a boca com a ponta romba de um aplicador de ponta de algodão e deslize no lugar. Certifique-se de que o cone do nariz esteja totalmente sobre o nariz do mouse ou a anestesia não será administrada corretamente. O cone do nariz não se encaixará no nariz se os dentes não estiverem assentados dentro desse sulco (Figura 2A inserida).
- Usando um cotonete estéril, coloque lubrificante ocular em cada um dos olhos do rato. A aplicação de lubrificante ocular atenua o ressecamento da córnea e reduz a chance de danos à córnea e complicações pós-operatórias relacionadas ao trauma da córnea.
- Estabilize o crânio do camundongo pressionando a barra da orelha esquerda contra o canto medial da orelha esquerda, travando-a no lugar usando o parafuso na estrutura estereotáxica. Em seguida, deslize a barra da orelha direita contra o canto medial da orelha direita e aperte firmemente a estrutura estereotáxica (Figura 2B).
nota: Certifique-se de que a cabeça do mouse esteja nivelada e reta ao colocar as barras auriculares. Se a cabeça estiver torta ou inclinada, a injeção estará no local incorreto no cérebro. As barras auriculares devem ser apertadas SOMENTE até que o crânio seja imobilizado após a estimulação com sondagem manual moderada.
3. Faça uma janela de calvário
- Prepare e limpe o couro cabeludo com 3 passagens alternadas de uma solução de betadina e etanol a 70%. Devido à proximidade do local cirúrgico com os olhos, use a solução de betadina sobre o esfoliante cirúrgico.
- Usando um bisturi estéril, faça uma incisão de 3 mm através da pele ao longo do aspecto mediano central do crânio (seguindo a linha de sutura sagital). O sangramento na incisão deve ser mínimo. Caso ocorra, aplique pressão consistente e firme no local do sangramento com um aplicador de ponta de algodão estéril por >30 segundos.
- Identifique e oriente a broca perpendicularmente ao bregma (Figura 2C), certificando-se de redefinir a escala digital Vernier para zero.
- Mova a broca 2 mm lateralmente à sutura sagital e 1 mm anterior à sutura coronal (Figura 2C). Para reprodutibilidade, certifique-se de que a localização à esquerda ou à direita da linha de sutura sagital permaneça consistente para todos os animais.
- Gire a furadeira para a velocidade mais alta. Certifique-se de que a pele seja afastada da broca para evitar danos aos tecidos causados pela broca rotativa e inicie cuidadosamente a broca no crânio. Faça um furo de aproximadamente 0,5 mm de profundidade através da calvária, resultando na janela da calvária. Tenha cuidado para não abaixar muito a broca ou ela perfurará o cérebro. Deixar cair solução salina estéril no local da broca enquanto a broca está em movimento pode compensar qualquer calor gerado pela máquina que possa causar danos térmicos ao tecido circundante.
- Uma vez feita a janela da calvária, levante cuidadosamente a broca e remova-a da estrutura estereotáxica.
- Limpe as brocas com etanol 70% e reserve se for usado novamente. Caso contrário, remova as brocas e mergulhe em etanol 70%.
