Ensaio de fagocitose microglial: um ensaio in vitro para estabelecer o modelo de fagocitose microglial para células de neuroblastoma usando macrófagos iPSC

Resumo

Fonte: Hall-Roberts, H. et al. Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células mortas de neuroblastoma por iPSC-macrófagos. J. Vis. Exp. (2021)

Neste vídeo, realizamos o ensaio de fagocitose microglial para neuroblastoma usando células-tronco pluripotentes induzidas. O ensaio ajuda a avaliar o comprometimento da função microglial em doenças neurodegenerativas.

Protocolo

1. Rotulagem de SH-SY5Ys mortos com corante fluorescente vermelho sensível ao pH

1. Comece com células SH-SY5Y fixas suspensas em meio tamponado HEPES sem vermelho de fenol. Conte as células e remova o número total de células necessárias em um tubo de 2 mL de baixa ligação a proteínas. Para cada 1 milhão de SH-SY5Ys, perfaça o volume total no tubo de 2 mL para 300–500 μL com meio tamponado HEPES sem vermelho de fenol. Aquecer brevemente o tubo num banho-maria a 37 °C.
2. Reconstitua o éster STP de corante fluorescente vermelho sensível ao pH (consulte a Tabela de Materiais) e adicione 12,5 μg de corante por milhão de SH-SY5Y ao tubo quente de células de 2 mL. Misture delicadamente pipetando. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 30 min, protegido da luz.
   nota: A espécie de éster STP do corante sensível ao pH reage com aminas primárias e, portanto, o tampão de marcação não deve conter aminas livres. Devido à solubilidade potencialmente limitada em tampões aquosos, adicione o corante dissolvido em DMSO apenas para aquecer o tampão aquoso, misture imediatamente e examine se há sinais de precipitado (partículas escuras sob um microscópio de luz).
3. Adicione 1 mL de HBSS e centrifugue a 1200 x g por 7 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante e lave com 2 mL de HBSS. Repita a centrifugação.
4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em meios de macrófagos sem vermelho de fenol (ver Tabela de Materiais) a uma concentração de 200.000 a 1,2 milhão de células / mL para que 50 μL sejam 10.000 a 60.000 células (ou seja, 0,5 a 3 vezes mais SH-SY5Ys do que iPSC-macrófagos).
   nota: O vermelho de fenol no meio aumenta a fluorescência de fundo e, portanto, o meio sem vermelho de fenol deve ser usado se a imagem de células vivas for realizada. O armazenamento dos SH-SY5Ys corados por mais de algumas horas não é recomendado, pois isso não foi avaliado. Mantenha SH-SY5Ys manchados no gelo e proteja-os da luz.

2. Coloração de iPSC-macrófagos

1. Em uma cabine de segurança biológica, prepare uma solução em meio de macrófagos de um corante reativo a éster succinimidílico fluorescente vermelho escuro, permeável às células (consulte a Tabela de Materiais). Adicione Hoechst 33342 (consulte a Tabela de Materiais). Aquecer a solução de trabalho a 37 °C em banho-maria.
2. Aspirar suavemente o meio iPSC-macrófago pipetando o sobrenadante celular com uma pipeta multicanal para um reservatório estéril. Adicione 70 μL / poço da solução de corante preparada na etapa 2.1 aos macrófagos iPSC, usando uma pipeta multicanal. Incubar durante 1 h a 37 °C e 5% de CO₂.
3. Preparar tratamentos experimentais em meios de macrófagos sem vermelho de fenol. Incluir 10 μM de citocalasina D como tratamento de controlo negativo. Após a incubação, aspirar o meio iPSC-macrófagos muito suavemente com uma pipeta multicanal e adicionar 100 μL/poço de solução salina tamponada de Hank (HBSS), para lavar. Remova imediatamente o HBSS por pipetagem suave e, em seguida, adicione 100 μL de meio ± compostos. Incubar por 10 min – 1 h a 37 ° C e 5% de CO₂.
   nota: A citocalasina D é um potente inibidor da actina e bloqueia a fagocitose. Para quaisquer tratamentos experimentais que exijam incubação mais longa, por exemplo, 24–72 h, realize o tratamento experimental antes da etapa 2.1, usando 100 μL/poço de tratamento em meio macrófago completo. Siga as etapas 2.1 a 2.3 de acordo com o protocolo para que a coloração celular seja realizada e, posteriormente, o tratamento seja reaplicado em meio de macrófagos sem vermelho de fenol pelo restante do ensaio de fagocitose.

3. Fagocitose por imagem

1. Imagens de alto conteúdo de células fixas
   1. Use uma pipeta multicanal para adicionar 50 μL do SH-SY5Ys rotulado por poço, adicionando ao lado de cada poço na borda do líquido. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ por 3-5 h.
   2. Após a incubação da fagocitose, aspire suavemente os sobrenadantes celulares pipetando com uma pipeta multicanal e descarte. Lavar uma vez com 100 μL de PBS.
   3. Fixe a placa adicionando 100 μL de paraformaldeído a 2% e incube por 15 min em temperatura ambiente.
   4. Aspire os poços e adicione 100 μL de PBS. Cubra com selador de placas e papel alumínio; Conservar a 4 °C até ser necessário.
      nota: A placa de ensaio pode ser armazenada assim por pelo menos uma semana sem degradação significativa do sinal; armazenamento mais longo não foi testado.
   5. Ligue o microscópio de imagem de alto conteúdo (consulte Tabela de materiais) e abra o software de captura de imagem. Carregue a placa de ensaio no microscópio clicando no ícone Carregar na parte superior da tela.
   6. Selecione a guia Configuração. Nos menus suspensos da caixa superior esquerda: selecione o tipo de placa apropriado, selecione a opção de foco automático Dois picos (padrão), selecione a objetiva 40x Água, NA1.1, selecione Modo confocal e selecione binning de 1.
   7. Lave a objetiva de água 40x antes de usar através do menu Configurações.
   8. Na caixa Seleção de canal, use o ícone + para adicionar os canais DAPI, Alexa 647 e Alexa 568. Ajuste-os para medir em um único plano de 1 μm. Otimize as configurações de tempo e potência para a eficiência de coloração da placa de ensaio.
      nota: Como diretriz, defina DAPI em 200 ms de exposição e 100% de potência, Alexa 647 em 1500 ms de exposição e 100% de potência e Alexa 568 em 100 ms de exposição e 40% de potência.
   9. Certifique-se de que os canais não sejam medidos simultaneamente clicando em Sequência de canais para separar os canais.
   10. Em Navegação | Defina o layout, selecione os poços de medição e selecione de 9 a 12 campos por poço.
   11. Durante a configuração, clique em um campo representativo no mapa da placa e verifique cada canal de medição por vez, para garantir que a coloração esteja presente e que as imagens estejam focadas, ajustando o deslocamento do canal.
   12. Para que os dados sejam carregados em um servidor para análise remota, clique na caixa Trabalhos Online e no nome de tela relevante; isso permitirá o upload automático dos dados para um servidor após a geração de imagens.
   13. Salve o protocolo de ensaio clicando no botão Salvar.
   14. Clique na guia Executar experimento na parte superior e nomeie a placa do experimento e, em seguida, clique em Iniciar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de centrífuga cônico de 15 mL	falcão	352096	Para centrifugação de células
Micropipetas monocanal de 2-20 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL
Paraformaldeído a 4% em PBS	Alfa Aesar	J61899	Para fixação de células
Placa de 6 poços, tratamento para cultura de tecidos
Placa de 24 poços AggreWell-800	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 34815	Placa de 24 poços de baixa aderência de micropoços para formação de corpos embrióides
Contador de células automatizado
Centrífuga de bancada
Microcentrífuga de bancada
CellCarrier-96 Ultra Microplacas, tratamento para cultura de tecidos, preto, 96 poços com tampa	Perkin Elmer	6055302	Microplaca tratada com cultura de tecidos (TC) de 96 poços com paredes de poço preto e fundo opticamente transparente, para ensaio de fagocitose
Software CellProfiler			Software de código aberto para análise de imagens de fagocitose obtidas por microscópio de lapso de tempo de células vivas. Baixe gratuitamente no site (http://cellprofiler.org/), este protocolo utilizou a versão 2.2.0.
Corante CellTracker Vermelho Escuro	Thermo Fisher	C34565	Corante reativo a éster succinimidílico fluorescente vermelho escuro, permeável a células para coloração do citoplasma de macrófagos iPS. Dissolva o corante CellTracker Deep Red em DMSO a 2 mM (1,4 mg/mL). Utilizar a 1 μM, por diluição da massa de DMSO com meios de macrófagos.
Gabinete de segurança de fluxo de ar laminar classe 2
Garrafa de gás CO2			Acessório para EVOS FL Auto
Incubadora de CO2, ajustada para 37 °C e 5% de CO2
Citocalasina D	Cayman	11330	Tratamento de controle negativo para ensaio de fagocitose. Reconstitua em DMSO a 10 mM e armazene alíquotas a -20 ° C, evite mais ciclos de congelamento e descongelamento. Utilizar na concentração final de 10 μM.
DMEM/F12	Gibco	11320074	Componente da mídia SH-SY5Y
Dmso	sigma	D8418	Solvente para corantes CellTracker e pHrodo
Soro fetal bovino	sigma	Rolamento F4135	Componente da mídia SH-SY5Y
Geltrex LDEV-Free, qualificado para hESC, matriz de membrana basal com fator de crescimento reduzido	Invitrogen	A1413302	Matriz de membrana basal qualificada para hESC para cultura de iPSC
Suplemento GlutaMAX	Gibco	Rolamento 35050-038	Componente de mídia de fábrica e macrófagos
HBSS	Lonza	SEJA 10-547F	Solução salina balanceada de Hank para etapas de lavagem
IL-3 recombinante humana	Gibco	PHC0033	Componente de mídia de fábrica e macrófagos
Solução de imagem de células vivas	Thermo Fisher	A14291DJ	Meios tamponados com HEPES sem vermelho de fenol para rotulagem de SH-SY5Ys mortos
Tubos de 2 mL com baixa ligação a proteínas	Eppendorf	Rolamento 30108.132	Para coloração SH-SY5Ys
M-CSF	Thermo Fisher	PHC9501	Componente de mídia de fábrica e macrófagos
mTeSR1 Médio	Tecnologias STEMCELL	85850	Mídia iPSC
Pipeta multicanal 20-200 uL			Para manuseio de líquidos de placas de 96 poços
Reagente NucBlue Live ReadyProbes	Thermo Fisher	R37605	Formulação Hoechst 33342 em um frasco conta-gotas para coloração de núcleos de macrófagos iPS, use 0,5 gotas/mL em meio de macrófagos.
Sistema de triagem de alto conteúdo Opera Phenix	Perkin Elmer	HH14000000	Microscópio de imagem de alto conteúdo, usado com o software Harmony versão 4.9.
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140-122	Componente de meios de fábrica, macrófagos e SH-SY5Y
pHrodo iFL Red STP-Éster	Thermo Fisher	Pág. 36011	Corante fluorescente vermelho sensível ao pH para rotular SH-SY5Ys mortos. Reconstitua o pó de éster pHrodo iFL Red STP em DMSO a uma concentração de 5 mg/mL. Para cada 1 milhão de SH-SY5Ys, adicione 2,5 μL (12,5 μg) de estoque de éster pHrodo iFL Red STP às células pré-aquecidas suspensas em solução de imagem de células vivas.
Envasadora de pipetas sorológica
Balão T175, tratado para cultura de tecidos			Vaso para diferenciações de precursores de iPSC-macrófagos, conhecidos como "Fábricas"
Balão T75			Recipiente para cultura SH-SY5Y
Seladoras de placas transparentes	Greiner Bio-One	676001	Para armazenamento e transporte de placas de ensaio
Banho-maria, regulado para 37°C
X-VIVO 15 Medium com L-glutamina, gentamicina e vermelho de fenol	Lonza	BE04-418F	Componente de mídia de fábrica e macrófagos
X-VIVO 15 Meio com L-glutamina; sem gentamicina ou vermelho de fenol	Lonza	04-744Q	Meios de macrófagos isentos de vermelho de fenol, para utilização em fagocitose sem aditivos ou factores de crescimento