Isolamento de Núcleos de Tecidos de Glioma Frescos Congelados: Um Método para Obter Núcleos Intactos de Amostras de Tumores de Glioma

Resumo

Fonte: Narayanan, A. et al. Isolamento de núcleos de tumores cerebrais frescos congelados para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo descreve o protocolo para isolar núcleos únicos de tecido de glioma fresco congelado. Os núcleos únicos isolados podem ser usados como espécimes para técnicas de sequenciamento, como sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA) e sequenciamento de ensaio de núcleo único para cromatina acessível por transposase (snATAC) para obter insights mais profundos sobre a heterogeneidade inter e intratumoral observada no glioma dos tecidos nervosos centrais.

Protocolo

1. Dissecção e dissociação de tecidos

1. Transfira a amostra de tecido fresco congelado (10–60 mg) para uma placa de Petri pré-resfriada. Pique / pique o tecido fresco congelado com uma lâmina de barbear em pequenos pedaços no gelo.
2. Adicione 500 μL de tampão de lise de núcleos resfriados a um tubo pré-resfriado de 1,5 mL. Colocar os pedaços de tecido no tubo de 1,5 mL contendo o tampão de lise dos núcleos e transferir para um Douncer (Tabela de Materiais).
   nota: Existem dois pilões homogeneizadores Dounce: pilão "solto" ou "A" para redução inicial da amostra e pilão "apertado" ou "B" para homogeneização completa da amostra.
3. Limpe os pedaços de tecido com o pilão "solto" por cerca de 20 golpes, até que o atrito seja reduzido. Se houver detritos, a amostra pode ser pré-limpa por filtração com um filtro de 100 mm.
4. Dounce com o pilão "apertado" por 20 golpes para obter a homogeneização completa do tecido.
5. Transfira o homogeneizado (cerca de 500 μL) para um tubo pré-resfriado de 2 mL. Adicione 1 mL de tampão de lise resfriado. Misture delicadamente e incube no gelo por 5 min. Misture suavemente com uma ponta de pipeta de diâmetro largo e repita 1–2 vezes durante a incubação.
6. Filtrar todo o homogeneizado utilizando uma malha de filtro de 30 μm, recolher para um tubo Falcon de 15 ml e transferir de volta para um novo tubo pré-arrefecido de 2 ml. Um único filtro é normalmente suficiente para todo o homogeneizado.
7. Verifique sob um microscópio óptico para verificar a remoção de grandes detritos e a integridade da membrana nuclear. Os núcleos precisam ser redondos e a membrana nuclear não deve ser distorcida. Se houver detritos, os núcleos podem ser filtrados novamente.
8. Centrifugar os núcleos a 500 x g durante 5 min a 4 °C numa centrífuga de bancada. Remova o sobrenadante, deixando para trás ~ 50 μL com um pellet contendo os núcleos. Ressuspenda suavemente o pellet em mais 1 mL de tampão de lise de núcleos e incube por 5 min em gelo.
9. Centrifugue os núcleos a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet, adicione 500 mL de tampão de homogeneização 1x (HB) (Tabela 1) e incube por 5 min sem ressuspender. Em seguida, ressuspenda os núcleos em mais 1,0 mL de 1x HB.
10. Centrifugue os núcleos a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente os núcleos em 200 μL de 1x HB em um novo tubo de 2,0 mL.

    Tabela 1: Preparação de 1x Solução Instável Tampão de Homogeneização (2 mL por amostra)

    1x Solução instável de tampão de homogeneização (2 mL por amostra)
    Reagente	Conc. Final	Vol por amostra (μL)
    6x Buffer de Homogeneização Instável	1x	333,33
    1 M de sacarose	320 mM	Nº 640,00
    50 mM EDTA	0,1 mM	4.00
    10% NP40	0,1%	20.00
    H2O		1006,27

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Mercaptoetanol	sigma	M6250
CaCl2	sigma	21115-100ML
EDTA (0,5 M)	Thermo Científico	R1021
Tubos de centrífuga cônicos Falcon 15 mL	Fisher Científico	352096
SmartStrainers MACS (100 μm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Mg(Ac)2	sigma	63052-100ML
NP-40	Abcam	ab142227
Kit de isolamento de núcleos: Nuclei EZ Prep	sigma	NUC101-1KT
Tubos de trava segura 1,5 mL	Eppendorf	30120086
Tubos de trava de segurança 2,0 mL	Eppendorf	30120094
sacarose	sigma	S0389
Ponteiras de pipeta de diâmetro largo (1000 μL)	Themo Fisher Científico	2079GPK