Purificação de Núcleos Baseada em Centrifugação de Gradiente: Uma Técnica para Obter Fração Ultrapura de Núcleos Intactos Usando Centrifugação de Gradiente de Densidade

Resumo

Fonte: Narayanan, A. et al. Isolamento de núcleos de tumores cerebrais frescos congelados para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq. (2020)

Neste vídeo, descrevemos um protocolo simples e eficiente usando centrifugação gradiente para isolar núcleos únicos. Uma vez isolados, esses núcleos podem ser usados para sequenciamento e análise do genoma.

Protocolo

1. Centrifugação de gradiente

1. Adicione 200 μL de solução de iodixanol a 50% (Tabela 1) para obter uma concentração final de 25% de iodixanol. Misture bem 10 vezes com uma pipeta de 300 mL.
2. Adicione 300 μL de solução de iodixanol a 29% (Tabela 2) sob a mistura de 25%. Use uma ponta fina P1000 para evitar a mistura das camadas.
3. Adicione 300 μl de solução de iodixanol a 35% (Tabela 3) sob a mistura de 29%. Use uma ponta fina P1000 para evitar a mistura das camadas.
   cuidado: Esta etapa requer a remoção gradual da ponta da pipeta durante a pipetagem para evitar deslocamento excessivo do volume.
4. Coloque as amostras em uma centrífuga de balde oscilante, gire por 20 min a 3.500 x g a 4°C com o freio desligado.
5. Remova cuidadosamente as amostras sem agitar e observe sob a luz. Uma faixa branca clara de 95% de núcleos puros deve ser visível entre a segunda e a terceira camada (Figura 1).

2. Isolamento de Núcleos

1. Aspire as camadas superiores até a faixa de núcleos brancos na interfase de 29% a 35%.
2. Coletar a banda dos núcleos em um volume de 200 mL, transferir para um tubo novo e filtrar com um filtro de 20 μm (Tabela de Materiais).
   nota: Os núcleos não precisam ser ressuspensos antes da filtração.
3. Verifique sob um microscópio óptico para verificar a remoção de grandes detritos e a integridade da membrana nuclear. Os núcleos precisam ser redondos e a membrana nuclear não deve ser distorcida.
4. Contar os núcleos utilizando a coloração com azul de tripano num hemocitómetro e alíquotas dos núcleos para snRNA-seq/snATAC-seq.

Tabela 1: Preparação do Buffer de Homogeneização 6x Stable Master Mix

6x Buffer de Homogeneização Master Mix Estável
Reagente	Conc. Final	Vol para 100 (mL)
1 M CaCl₂	30 mM	3.0
1 M Mg(Ac)₂	18 mM	1.8
1 M Tris pH 7,8	60 mM	6.0
H₂O		89,2
Mantenha em temperatura ambiente, evite a exposição direta à luz

Tabela 2: Preparação de sacarose 1 M

1 M de sacarose

34,23 g de sacarose

Dissolver em 78,5 mL de água

Encha até 100 mL com água

Tabela 3: Preparação de 6x Solução Instável Tampão de Homogeneização (650 μL por amostra)

6x Solução instável de tampão de homogeneização (650 mL por amostra)
Reagente	Conc. Final	Vol por amostra (μL)
6x Tampão de Homogeneização Estável	6x	648,84
100 mM PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila)	0,1 mM	1,08
14,3 M β-mercaptoetanol	1 mM	0,08

Resultados

Figura 1: Fluxograma para isolamento de núcleos. O fluxograma fornece uma breve visão das etapas envolvidas no isolamento de núcleos únicos de um tecido de glioma fresco congelado. Imagens representativas para a amostra do tumor e a banda nuclear após o gradiente de iodixanol/sacarose (circulado com linha pontilhada vermelha) são mostradas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
EDTA (0,5 M)	Thermo Científico	R1021
Centrífuga Cônica Falcon 15 mL Tubos	Fisher Científico	352096
Iodixanol (também conhecido como Optiprep)	Tecnologias de células-tronco	07820
NP-40	Abcam	ab142227
Tubos de trava segura 1,5 mL	Eppendorf	0030120086
Tubos de trava de segurança 2,0 mL	Eppendorf	0030120094
sacarose	sigma	S0389
Ponteiras de pipeta de diâmetro largo (1000 μL)	Themo Fisher Científico	2079GPK
Ponteiras de pipeta de diâmetro largo (200 μL)	Themo Fisher Científico	2069GPK