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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Fixação e coloração de seções de tecido cerebral criopreservado
- Para preservar a integridade do RNA, limpe todos os instrumentos a serem usados com a solução de limpeza RNase. Proceder ao protocolo de fixação e coloração no interior de uma hotte.
- Prepare as soluções fixadoras descritas em tubos limpos de 50 mL sem RNase. Faça todas as soluções com água sem RNase no dia da coloração.
- No mesmo dia será realizada a microdissecção a laser, prepare soluções de etanol a 100%, 95%, 70% e 50%. Mantenha as soluções em tubos bem fechados à temperatura ambiente.
- Prepare violeta de cresil a 4% e eosina Y a 0,5% em solução de etanol a 75%. Vortex a solução vigorosamente por 1 min e filtre-os através de um filtro de nylon de 0,45 μm para eliminar vestígios de pó não dissolvido.
- Coloque as lâminas de tecido em um recipiente com etanol a 95% por 30 s. Transfira as lâminas para o tubo contendo 75% de etanol; deixe as lâminas por 30 s.
- Transfira as lâminas para etanol a 50% e deixe-as lá por 25 s. Neste ponto, a OCT será dissolvida. Transfira a lâmina para solução de violeta de cresil a 4% por 20 s e, em seguida, transfira para solução de eosina Y a 0,5% por 5 s.
- Retire a lâmina da solução de corante e seque-a com um papel de filtro. Em seguida, coloque as lâminas em etanol a 50% por 25 s. Transfira as lâminas para etanol a 75% por 25 s. Transfira as lâminas para etanol a 95% por 30 s. Transfira as lâminas para etanol 100% por 60 s.
- Enxágue a lâmina com xileno. Transfira-os para um recipiente com xileno e aguarde 3 min.
- Prepare o meio de montagem (por exemplo, goma Pinpoint) em água sem RNase. Para montar seções cerebrais de camundongos, dilua o meio de montagem em água livre de RNase na proporção de 1:10.
- Seque as lâminas em uma superfície livre de RNase em temperatura ambiente por 10 s. Antes que o xileno seque, prossiga para a montagem das lâminas com as seções de tecido.
- Disperse suavemente a solução de montagem em cima do tecido na lâmina com um pincel fino estéril e sem RNase. Aguarde de 10 a 20 s e, em seguida, transfira imediatamente as lâminas de tecido para a plataforma de microdissecção do microscópio.
NOTA: A proporção de meio de montagem para água livre de RNase usada para montagem varia dependendo do tecido de interesse. A proporção meio/água de montagem preserva a morfologia do tecido do glioma para microdissecção a laser sem afetar a integridade do RNA.