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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de suspensão de célula única do cérebro
- Dilua o meio de gradiente de densidade na proporção de 9:1 com PBS em um tubo cônico de 15 mL para obter uma solução final de 100%.
- Anestesiar camundongos no pico da EAE com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1% (50 mg / kg) e perfundir intracardiologicamente com 20 mL de PBS estéril gelado. Consiga isso injetando lenta e firmemente PBS no ventrículo esquerdo do coração usando uma seringa de 20 mL e abrindo o átrio direito.
- Corte o crânio cuidadosamente do nariz ao pescoço e, em seguida, remova o cérebro da caixa craniana em 10 mL de RPMI em tubos cônicos de 50 mL. Misture bem para remover os glóbulos vermelhos aderentes. Em seguida, remova o meio por aspiração e adicione 10 mL de RPMI.
- Coloque o cérebro e o meio em um prato de 100 mm. Pique finamente com uma lâmina de barbear.
- Transfira 6 mL do prato para um homogeneizador de vidro sinterizado de 7 mL gelado com uma pipeta limpa. Evite deixar grandes quantidades de tecido na pipeta. Uma pequena quantidade é inevitável.
- Moa o cérebro usando o êmbolo "solto" do pilão primeiro, depois use o êmbolo "apertado" até que a suspensão fique homogênea e despeje em um tubo cônico pré-resfriado de 15 mL e mantenha no gelo.
- Depois que todas as amostras estiverem homogeneizadas, estime o volume. Ajuste o volume com RPMI para 7 mL. Em seguida, coloque 3 mL de matriz de membrana basal 100% gelada em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL resfriado e adicione 7 mL do homogeneizado cerebral para produzir um meio final de gradiente de densidade de 30%. Misture por inversão algumas vezes. Não vórtice.
- Para garantir uma interface nítida, adicione cuidadosa e lentamente 1 mL de 70% de meio gradiente de densidade de underlay em RPMI com uma pipeta de 3 mL.
- Centrifugue a 800 x g por apenas 20 min a 4 °C. Defina a aceleração para 1 e a desaceleração para 0. Após a centrifugação, aspirar quase toda a fase superior, tendo o cuidado de remover completamente a mielina no topo (Figura 1).
- Remova a interface em um novo tubo de centrífuga 15. Ajuste o volume para 10 mL com RPMI.
- Centrifugue a 500 x g por 10 min. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em ~ 200 μL de tampão de coloração por citometria de fluxo (FSC).
