Extração baseada em imunoafinidade de peptídeos ubiquitinilados: uma técnica para extrair seletivamente peptídeos marcados com ubiquitina de frações peptídicas purificadas

Resumo

Fonte: Bezstarosti, K. et al. Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo descreve um método para extrair e purificar peptídeos ubiquitinilados contendo peptídeos de diglicina remanescentes de uma mistura complexa de peptídeos. O método apresentado pode ajudar na identificação de locais de ubiquitinação originais na proteína.

Protocolo

1. Extração de peptídeos ubiquitinilados

1. Use cromatografia C18 de fase reversa de pH alto (RP) com material polimérico de fase estacionária (300 Å, 50 μM; consulte Tabela de Materiais) carregado em um cartucho de coluna vazio para fracionar os peptídeos trípticos. O tamanho do leito da fase estacionária deve ser ajustado à quantidade de digestão de proteína a ser fracionada. Prepare um cartucho de coluna vazio de 6 mL (consulte a Tabela de Materiais) cheio de 0,5 g de material de fase estacionária para ~ 10 mg de digestão de proteína. A proporção entre a digestão da proteína e a fase estacionária deve ser de aproximadamente 1:50 (p / p).
2. Carregue os peptídeos na coluna preparada e lave a coluna com aproximadamente 10 volumes de coluna de 0,1% de TFA, seguidos por aproximadamente 10 volumes de coluna de H2O.
3. Eluir os peptídeos em três frações com 10 volumes de coluna de solução de formiato de amônio 10 mM (pH = 10) com 7%, 13,5% e 50% de acetonitrila (AcN), respectivamente. Liofilizar todas as frações até a completude.
4. Use anticorpos de motivo remanescente de ubiquitina (K-ε-GG) conjugados a grânulos de agarose de proteína A para o imunoenriquecimento de peptídeos diGly. Como a quantidade exata de anticorpos por lote de grânulos é uma informação proprietária e não divulgada pelo fabricante, é recomendável usar a mesma definição para um lote de grânulos que o fabricante faz para evitar confusão. Lave um lote desses grânulos 2x com PBS e divida a pasta do grânulo em seis frações iguais. Veja a Figura 1 para um esquema experimental detalhado.
5. Dissolva as três frações peptídicas coletadas na etapa 1.3 em 1.4 mL de um tampão composto de 50 mM MOPS, 10 mM de fosfato de sódio e 50 mM de NaCl (pH = 7,2) e gire os detritos.
6. Adicionar os sobrenadantes das fracções aos grânulos de anticorpos diGly e incubar durante 2 h a 4 °C numa unidade rotadora. Girar os grânulos e transferir o sobrenadante para um novo lote de grânulos de anticorpos e incubar novamente durante 2 h a 4 °C.
7. Armazene os sobrenadantes para análise subsequente do proteoma global (GP).
8. Transfira os grânulos de cada fração para uma ponta de pipeta de 200 μL equipada com um plugue de filtro GF/F para reter os grânulos. Coloque a ponta da pipeta com os grânulos em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL equipado com um adaptador de ponta de centrífuga. Lave as esferas 3x com 200 μL de tampão IAP gelado e, posteriormente, 3x com 200 μL de Milli-Q H₂O. Gire a coluna a 200 x g por 2 minutos antes de cada etapa de lavagem, mas tome cuidado para não deixar a coluna secar. Eluir os peptídeos usando 2 ciclos de 50 μL de TFA a 0,15%.
9. Dessalinize os peptídeos usando uma ponta de estágio C18 (essencialmente uma ponta de pipeta de 200 μL com dois discos C18) e seque-os até a íntegra usando centrifugação a vácuo.

Resultados

Figura 1: Visão geral experimental.(A) Visão geral da abordagem experimental. As amostras foram preparadas, tripsinizadas e fracionadas em três frações usando cromatografia de fase reversa com eluição de pH alto. Um lote de grânulos comerciais de anticorpos peptídicos α-diGly foi dividido em seis frações iguais e as três frações peptídicas foram então carregadas em três das frações de grânulos. Os peptídeos diGly foram imunopurificados,...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lisil Endopeptidase (LysC)	Wako Pure Chemicals	129-02541
Forno NanoLC	Projeto MPI, MS Wil GmbH
Sal de sódio N-Lauroilsarcosina	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass espectrómetro	ThermoFisher
PLRP-S (300 Å, 50 μm) polimérico partículas de fase reversa	Tecnologias Agilent	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitina Remanescente Motivo (K-ε-GG) Kit	Tecnologias de sinalização celular	Rolamento 5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartucho	Águas	WAT036790	Remova o material tC18 do cartucho antes de encher o cartucho com PLRP-S
Desoxicolato de sódio	Sigma-Aldrich	Rolamento 30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Tripsina tratada com TPCK	ThermoFisher	20233