Ensaio de síntese de DNA: uma técnica para avaliar a síntese de DNA em células em proliferação usando incorporação de timidina tritiada radioativa

Resumo

Fonte: Williams, M. et al. Detecção rápida de fenótipos de neurodesenvolvimento em células precursoras neurais humanas (NPCs). J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, determinamos a capacidade proliferativa das células progenitoras neuronais medindo a incorporação de timidina tritiada com marcador radioativo no DNA das células. Esta técnica pode ser usada para estudar a proliferação celular após o tratamento com certos medicamentos e fatores de crescimento.

Protocolo

1. Manutenção de NPCs

1. Placa NPCs com uma densidade de 1,5 milhão de células em um poço revestido com gel imitador de ECM contendo 2 mL de 100% de meio de expansão.
2. Incubar NPCs a 37 °C em um ambiente úmido com 5% de CO₂.
3. Adicione 5 μM de inibidor de ROCK ao meio para NPCs em P3 ou inferior, ou para NPCs descongelados, para evitar a morte celular excessiva. Troque o meio após 24 h para remover o inibidor de ROCK.
4. Células de passagem a cada 4-9 dias, dependendo de quando se tornam confluentes. As células são consideradas confluentes quando se tornam uma monocamada densamente compactada cobrindo todo o fundo da superfície do prato.
5. NPCs de placa a uma densidade de 1 a 1,5 milhão de células por um poço de uma placa de 6 poços. Remova a mídia gasta a cada 48 h e substitua por 2 mL de mídia de expansão 100%.

3. Ensaio de Síntese de DNA de Células Precursoras Neurais

1. Placa de 100.000 células/poço em uma placa de 24 poços e avaliar em triplicata/condição.
2. Adicionar [³H]-timidina tritiada radioativa ao meio de cultura (1,5 μCi/ml) em cada alvéolo após 46 h em cultura. Incubar células a 37 °C por 2 h.
   nota: Ao usar materiais radioativos, receba treinamento de sua instituição, siga os protocolos de segurança de radioatividade e descarte os materiais radioativos nos recipientes de lixo devidamente designados.
3. Remova e descarte adequadamente os meios radioativos após 2 h. Adicione 300 μL de tripsina-EDTA a 0,25% pré-aquecido (0,5 mM) a cada poço e incube por 20 min a 37 ° C.
4. Ligue o coletor de células (consulte a seção Materiais) e a bomba e certifique-se de que a pressão da bomba esteja abaixo de 200 PSI. Coloque papel de filtro no espaço do coletor de células e rasgue o canto direito para marcar a orientação do papel.
5. Coloque os tubos coletores do coletor de células em uma bandeja vazia "em branco" e pressione a pré-lavagem para umedecer o papel de filtro. Coloque os tubos de coleta nos poços de amostra e execute (iniciar).
6. Quando o coletor de células terminar de coletar amostras, levante o grampo e avance o papel de filtro para repetir para todos os conjuntos de amostras. Sempre pré-lave em um prato vazio e "em branco".
7. Seque o papel de filtro sob uma fonte de luz e coloque os frascos correspondentes em uma bandeja. Perfure chads de papel em frascos e adicione 2 mL de coquetel de cintilação líquida a cada frasco. Tampe e rotule os frascos.
8. Incube frascos em um coquetel de cintilação líquida por pelo menos 1 h antes de ler as contagens por minuto (CPMs) em uma máquina de cintilação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio DMEM/F12 avançado	ThermoFischer Científico	Rolamento 12634-010	Componente de 100% de Meio de Expansão
Meio Neurobasal	ThermoFischer Científico	21103049
Placas de 24 poços	ThermoFischer Científico	2021-05	Placas de poliestireno: Usado para ensaio de síntese de DNA NPC
Laminina de rato natural	Invitrogen	Rolamento 23017-015	Substrato para placas de revestimento: Usado para síntese de DNA NPC, entrada na fase S e ensaios de número de células
Penicilina/estreptomicina	ThermoFischer Científico	15140122	Antibiótico, componente em meios de expansão
2,5% de tripsina (10X)	Gibco	15090-046	Solução enzimática 10X
0,5 M EDTA	ThermoFischer Científico	AM9261	Usado em solução de tripsina para levantar células para ensaio de síntese de DNA
[3H]-timidina tritiada	PerkinElmer	NET027E001	Trítio radioativo, timidina
Frascos de cintilação HDPE de 7 mL da Fisherbrand	Marca de pescador	03-337-1	Frascos para contagem de cintilação líquida
EcoLite(+)	MP Biomédicos	188247501	Coquetel de cintilação líquida
Contador de cintilação líquida multiuso LS 6500	Beckman Coulter	8043-30-1194	Contador de cintilação líquida
Colheitadeira de Células Semi-automática Skatron	Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc.	Tipo 11019	Colheitadeira de células semiautomática
Papel de filtro GF / C de grau, Whatman	Ciências da Vida da GE Healthcare	1822-849	Papel de filtro de fibra de vidro