Ensaio de Neuroesfera NPC: Um Ensaio In Vitro para Avaliar a Resposta Migratória de Células Precursoras Neurais da Neuroesfera

Neste artigo

Resumo

Fonte: Williams, M. et al. Detecção rápida de fenótipos de neurodesenvolvimento em células precursoras neurais humanas (NPCs).J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o ensaio de migração da neuroesfera de células precursoras neurais - um ensaio in vitro para estudar a resposta migratória de células precursoras neurais da neuroesfera - por meio de análise microscópica.

Protocolo

1. Ensaio de Migração da Neuroesfera NPC

Formação de Neuroesferas
1. Adicione 1 mL de 100% de Mídia de Expansão em um prato de 35 mm sem substrato de revestimento. Incube as placas por pelo menos 15 min a 37 °C antes de plaquear os NPCs. Prepare 2–3 placas para garantir que haja neuroesferas suficientes para o ensaio de migração celular.
  nota: A ausência de um substrato de revestimento garante que os NPCs permaneçam suspensos no meio, o que é essencial para a formação da neuroesfera. Revestir pratos impedirá a formação de neuroesferas.
2. Levante, dissocie e pellet células. Ressuspenda o pellet celular em 2–5 mL de meio de expansão 100% pré-aquecido. Coloque 1 milhão de NPCs em cada prato de 35 mm preparado na seção 1.1.1.
3. Incube NPCs a 37 ° C por 48 a 96 h para permitir que os NPCs se agreguem e formem neuroesferas. Avalie o tamanho da esfera usando uma régua viva em um microscópio de contraste de fase. Aguarde até que a maioria das esferas atinja um diâmetro aproximado de 100 μm (± 20 μm) (Figura 1). Esferas menores se dispersarão completamente e se separarão durante o ensaio de migração.
Preparação de placas para ensaio de migração de neuroesferas
1. Dissolva as alíquotas de gel que imitam ECM em 6 mL de meio de expansão a 30%. Uma vez preparada a solução de gel que imita ECM/Meio de Expansão a 30%, adicione veículos, fatores de crescimento ou medicamentos de interesse nas concentrações desejadas.
  nota: As concentrações de veículos, medicamentos e fatores de crescimento precisam ser aumentadas para levar em conta a adição de 200 μL de neuroesferas na seção 1.3.
2. Placa 1 mL da solução de gel imitador de ECM / 30% de mídia de expansão (± veículos, fatores de crescimento ou medicamentos) em um poço de uma placa de 6 poços. Faça 2–3 poços por condição experimental. Em alternativa, podem ser utilizados pratos de 35 mm. Incubar as placas durante pelo menos 30 min a 37 °^C.
  nota: NÃO aspire a solução de gel imitador de ECM/meio de expansão a 30% para este ensaio. O revestimento de esferas em um gel ECM-Mimic aspirado levará a uma migração rápida e excessiva.
Neuroesferas de revestimento
1. Colete as neuroesferas formadas na seção 1.1 e coloque-as em um tubo cônico. Lave os pratos de 35 mm com 1 mL de 1x PBS para garantir que todas as neuroesferas sejam coletadas. Gire as neuroesferas coletadas a 100 x g por 5 min.
2. Ressuspenda as neuroesferas em 1–3 mL de meios de expansão a 30% pré-aquecidos. Se 1 prato de neuroesferas for coletado, 1 mL de meio é usado para ressuspender as esferas. Se 2 pratos forem coletados, 2 mL de meio são adicionados para ressuspender as esferas, etc. Pipete suavemente e use apenas um P-1000 para garantir que as esferas não sejam quebradas.
3. Colocar 200 μL das neuroesferas ressuspensas no gel imitador de ECM/solução de expansão a 30% feita na seção 1.2. Placas de rocha em todas as direções para distribuir uniformemente as neuroesferas. Incubar as placas durante 48 h a 37°C.
4. Remova a solução de gel imitador de ECM/30% de mídia de expansão e fixe as células em 4% de PFA, lave e mantenha as células em 1x PBS + 0,05% de azida de sódio.
Análise de Neuroesferas
1. Adquira imagens de neuroesferas inteiras usando configurações de contraste de fase em 10X. Certifique-se de que as esferas não estejam se tocando. Meça a migração média usando o software ImageJ.
2. Trace o contorno externo da neuroesfera usando a ferramenta de linha à mão livre. A linha à mão livre pode ser acessada clicando com o botão direito do mouse no ícone de linha "reta". Rastreie manualmente usando um mouse.
3. Use a função de medida para calcular a área do traço. Certifique-se de que "área" esteja selecionada como uma leitura na janela "Definir medidas" encontrada na guia Analisar. Veja a Figura 2 para traçar o contorno externo em azul.
4. Trace a massa celular interna da esfera e meça a área. Veja a Figura 2 para traçar o contorno interno em vermelho. Quantifique a migração média subtraindo a massa celular interna da área total da neuroesfera.
5. Meça as neuroesferas que exibem uma massa celular interna densamente compactada com células migrando como um tapete contíguo (Figura 2).
6. Não inclua células fora do tapete ou separadas da neuroesfera para medição. Veja a Figura 2 para exemplos de células (circuladas em branco) que são excluídas da medição do carpete externo. Analise um mínimo de 20 neuroesferas para cada condição.

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Resultados

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Figura 1: Seleção de neuroesferas para ensaio de migração. (A) Imagem de contraste de fase de um campo representativo de neuroesferas em 24 h. As esferas têm menos de 100 μm e, portanto, não são coletadas para o ensaio de migração. (B) Imagem de contraste de fase de um campo representativo de neuroesferas em 72 h. Todas as esferas estão dentro da faixa de 100 μm ± 20 μm, indicando que estão prontas para...