Isolamento de astrócitos: um método para obter preparação pura de astrócitos corticais de camundongos

Resumo

Fonte: Schildge, S. et al. Isolamento e cultura de astrócitos corticais de camundongos. J. Vis. Exp. (2013)

Neste vídeo, descrevemos o método para obter uma preparação pura de astrócitos de camundongos recém-nascidos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Isolamento e plaqueamento de células corticais mistas

O isolamento misto de células corticais para culturas de astrócitos pode ser realizado usando filhotes de camundongos P1 a P4. Para atingir a densidade adequada de astrócitos, é necessário usar 4 córtices de filhotes de camundongo por frasco de cultura de tecidos T75. Portanto, os volumes no protocolo a seguir são calculados para uma preparação de células usando 4 filhotes de camundongo.

1. Antes de iniciar o procedimento de dissecação, pré-aqueça 30 mL de meios de cultura de astrócitos (DMEM, glicose alta + 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor + 1% de penicilina/estreptomicina; ver tabela) a 37 °C. Cubra um frasco T75 com 20 mL de poli-D-lisina (PDL) a uma concentração de 50 μg/mL em água de cultura de células por 1 hora a 37 °C na incubadora de CO₂.
2. Para o procedimento de dissecação, prepare todos os reagentes e materiais necessários. Você precisará de tesoura cirúrgica, pinça fina lisa, pinça de ponta plana, toalhas de papel, saco de lixo, etanol a 70% e 2 pratos de dissecação (3,5 cm de diâmetro) em gelo preenchido com 2 mL de HBSS cada.
3. Segure e borrife suavemente a cabeça e o pescoço do filhote de camundongo com etanol 70%. O animal é sacrificado por decapitação com tesoura.
4. Faça uma incisão na linha média, posterior a anterior, ao longo do couro cabeludo para revelar o crânio.
5. Corte o crânio cuidadosamente do pescoço ao nariz. Dois cortes adicionais são realizados para permitir mais acesso ao cérebro: o primeiro corte é feito anterior aos bulbos olfatórios, o outro inferior ao cerebelo para desconectar o crânio da base do crânio.
6. Usando a pinça de ponta plana, os retalhos cranianos são suavemente virados para o lado e o cérebro é retirado e colocado na primeira placa de dissecação preenchida com HBSS. Coloque o prato de volta no gelo e continue colhendo todos os 4 cérebros.
7. O restante do procedimento de dissecção é realizado sob um estereomicroscópio. Primeiro, os bulbos olfatórios e o cerebelo são removidos usando a pinça de dissecação fina (Figura 1B).
8. Para recuperar os córtices, agarre a extremidade posterior do cérebro com a pinça fina, faça uma incisão na linha média entre os hemisférios, insira um segundo conjunto de pinças no bosque criado e retire a estrutura em forma de placa do córtex do cérebro.
9. Disseque cuidadosamente as meninges dos hemisférios do córtex puxando com a pinça fina (Figura 1D'). Esta etapa evita a contaminação da cultura final de astrócitos por células meníngeas e fibroblastos. Transfira os hemisférios do córtex preparados para o segundo prato cheio de HBSS e coloque-o de volta no gelo. Continue de acordo com todos os 4 córtices.
10. Finalmente, corte cada hemisfério do córtex em pedaços pequenos usando lâminas afiadas (aproximadamente 4 a 8 vezes).
11. Em condições estéreis, transfira os pedaços do córtex para um tubo Falcon de 50 mL e adicione HBSS a um volume total de 22,5 mL.
12. Adicionar 2,5 ml de tripsina a 2,5 %, misturar e incubar o tecido em banho-maria a 37 °C durante 30 min. Misturar agitando ocasionalmente de 10 em 10 min.
13. Centrifugue por 5 min a 300 x g para pellet pedaços de tecido do córtex.
14. Remover cuidadosamente o sobrenadante por decantação. Para evitar a perda do pellet de tecido, você pode retê-lo mecanicamente usando uma pipeta. Dissocie o tecido em uma única suspensão celular adicionando 10 mL de meio de plaqueamento de astrócitos e pipetagem vigorosa usando uma pipeta de plástico de 10 mL até que os pedaços de tecido sejam dissociados em células únicas (20 a 30 vezes). Ajuste o volume para 20 mL usando meio de plaqueamento de astrócitos. Você pode provar a dissociação do tecido do córtex em células únicas contando usando um hematocitômetro. Uma preparação de 4 córtices de filhote de camundongo deve produzir 10–15 x10⁶ células individuais dissociadas.
15. Aspirar PDL do balão de cultura T75, colocar em placas a suspensão unicelular dissociada e incubar a 37 °C na incubadora de CO₂.

2. Obtendo uma cultura de astrócitos enriquecida

1. Troque o meio 2 dias após o plaqueamento das células corticais mistas e todos os 3 dias seguintes.
2. Após 7 a 8 dias, quando os astrócitos são confluentes e a micróglia sobreposta fica exposta na camada de astrócitos ou já está separada da camada de astrócitos (Figura 2), agite o frasco T75 a 180 rpm por 30 min em um agitador orbital para remover a micróglia. Descarte o sobrenadante contendo microglia ou, se desejar cultivar e examinar a microglia, gire-o para baixo e coloque um prato para cultura.
3. Adicione 20 ml de meio de cultura de astrócitos frescos e continue agitando o frasco a 240 rpm durante 6 horas para remover as células precursoras de oligodendrócitos (OPC). Como alguns OPCs não se desprendem completamente da camada de astrócitos, continue a agitar vigorosamente com a mão por 1 min para evitar a contaminação por OPC. Descarte o sobrenadante ou gire-o para baixo e coloque-o em um prato, se desejar cultivar OPCs.
4. Enxágue a camada confluente restante de astrócitos duas vezes com PBS, aspire o PBS, adicione 5 mL de tripsina-EDTA e incube na incubadora de CO₂ a 37 ° C. Verifique o desprendimento dos astrócitos a cada 5 minutos e reforce o desprendimento dos astrócitos batendo o frasco contra a palma da mão (2 a 3 vezes).
5. Depois que os astrócitos forem destacados do frasco de cultura, adicione 5 mL de meio de cultura de astrócitos, gire as células a 180 x g por 5 min, aspire o sobrenadante e adicione 40 mL de meio de plaqueamento de astrócitos fresco. Um balão de cultura de tecidos T75 deve produzir cerca de 1x10⁶ células após a primeira divisão celular. Plaquear as células em dois frascos de cultura T75 e incubar a 37 °C na incubadora de CO₂. Troque o meio a cada 2 a 3 dias.
6. 12 a 14 dias após a primeira divisão, os astrócitos são plaqueados na concentração celular apropriada 24 a 48 horas antes de realizar o experimento. Um frasco de cultura de tecidos T75 deve produzir cerca de 1,5–2 x10⁶ células após a segunda divisão celular.

Resultados

Figura 1. Dissecção do córtex de camundongo pós-natal (P3). A) Cérebro inteiro. B) Cérebro após remoção de bulbos olfatórios e cerebelo. C) Isolamento de córtices descascando a estrutura em forma de placa do córtex do cérebro. D, D') Córtex do local ventral e dorsal com meninges (setas pretas indicam artérias meníngeas). E) Córtex sem meninges. Barra de escala, 1,5 mm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meios de cultura de astrócitos
DMEM glicose alta	Tecnologias da Vida	Rolamento 31966-021
FBS termo-inativado	Tecnologias da Vida	10082-147	Concentração Final: 10%
Penicilina-estreptomicina	Tecnologias da Vida	15140-122	Concentração Final: 1%
Solução para digestão do tecido cerebral
HBSS	Tecnologias da Vida	14170-088
2,5% de tripsina	Tecnologias da Vida	15090-046	Concentração Final: 0,25%
outro
70% (vol/vol) de etanol	Roth	9065.2
Poli-D-Lisina	Milipor A-003	A-003-E
Água	PAA	S15-012	Grau de cultura celular
Pbs	PAA	H15-002	Grau de cultura celular
0,05% de tripsina-EDTA	Tecnologias da Vida	Rolamento 25300-062
Filtro estéril de 0,45 μm	Sartorius	16555
Placa de Petri de 3,5 cm	Falcão BD	353001
Tubo Falcon de 15 ml	Falcão BD	352096
Tubo Falcon de 50 ml	Falcão BD	Rolamento 352070
75 cm2 Balão de cultura de tecidos	Falcão BD	353136
Fórceps fino	Dumont	2-1032; 2-1033	#3c; #5
Ponta plana de pinça	KLS Martin	12-120-11
Tesoura cirúrgica de 13 cm	Aesculap	BC-140-R
Estereomicroscópio	Leica		MZ7.5
Estereomicroscópio + Câmera	Leica		MZ16F; DFC320
Microscópio + Câmera	Zeiss; Cônego		Primo Vert; PowerShot A650 IS
centrifuga	Eppendorf	Rolamento 5805000.017	centrífuga5804R
Agitador Orbital	Thermo Científico	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
Banho-maria	Julabo		SW20; 37 °C