Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Isolamento de microvasos cerebrais de ratos
- Para cada preparação e para um experimentador, use 3 ratos Wistar de cinco semanas.
- Segunda-feira da primeira semana, preparar 2 frascos T75 revestidos com colagénio tipo IV e fibronectina, ambos a 1 μg/cm2 em água de cultura estéril (10 ml por T75). Deixar aderir a 37 °C até à semeadura dos microvasos.
- Na manhã de quarta-feira da primeira semana, eutanasiar os ratos sob um fluxo crescente de CO2 para induzir sonolência, perda de postura e interrupção da respiração, seguida de luxação cervical. Pulverize as cabeças com etanol 70%. Corte as cabeças com uma tesoura e transfira-as para uma placa de Petri seca sob uma capela de fluxo laminar.
- Remova os cérebros do crânio sem o cerebelo e os nervos ópticos e, em seguida, transfira-os para uma placa de Petri resfriada em gelo e preenchida com tampão de dissecção a frio (HBSS suplementado com 1% de BSA, penicilina 100 unidades / ml e estreptomicina 100 μg / ml).
- Corte os cérebros ao meio para separar os 2 hemisférios cerebrais e separar o mesencéfalo do prosencéfalo. Transfira os prosencéfalos para uma placa de Petri limpa no gelo com tampão de dissecação.
- Pegue alguns hemisférios em uma nova placa de Petri com tampão de dissecção a frio para remover cuidadosamente as meninges dos prosencéfalos sob um estereomicroscópio com pinça curva N° 5. Em seguida, limpe o interior do cérebro para remover o edredom de mielina e obter uma concha de córtex. Essas etapas não devem levar mais de 2 horas para preservação do tecido e sobrevivência celular.
- Dissocie o córtex de 3 cérebros em 6 mL de tampão de dissecção a frio em um homogeneizador de 7 mL em 10 golpes para cima e para baixo com cada um dos 2 pilões de diferentes folgas, 71 μm seguidos por 20 μm.
- Divida a suspensão para obter o equivalente a 1 córtex em 1 mL de um tubo Falcon de 50 mL e centrifugue a 1.000 x g por 5 min em RT. Descarte o sobrenadante.
- Digerir a suspensão de 1 córtex com 1 mL de uma solução enzimática contendo uma mistura de colagenases/dispersões (60 μg/mL–0,3 U/mL), DNase tipo I (35 μg/mL–20 K unidades/mL) e gentamicina (50 μg/mL) em um agitador por 30 min a 37 °C.
- Misture o digestor de 1 mL de 1 córtex com 10 mL de BSA / HBSS 1X a 25% e separe por centrifugação dependente da densidade a 3.600 x g por 15 min em RT. Transfira cuidadosamente o disco superior (mielina e parênquima cerebral) e o sobrenadante para um tubo Falcon limpo de 50 mL e repita a centrifugação. Manter o sedimento resultante contendo os microvasos cerebrais a 4 °C.
- Descarte cuidadosamente o disco superior e o sobrenadante. Ressuspenda os dois pellets resultantes contendo os microvasos cerebrais com 1 mL de HBSS 1X frio e transfira para um tubo Falcon limpo de 50 mL.
- Lave os microvasos adicionando 20 mL de HBSS 1X frio e centrifugue a 1.000 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante.
- Além disso, digerir os microvasos de 1 córtex com 1 mL da mesma solução enzimática descrita na etapa 1.9 durante 1 hora a 37 ° C em um agitador.
- Em seguida, misture os microvasos digeridos de cada um dos 3 córtices em um tubo e separe-os em dois tubos Falcon de 50 mL para obter microvasos extraídos do equivalente a um córtex e meio (1,5) por tubo. Adicione 30 mL de tampão de dissecação a frio e centrifugue a 1.000 x g por 5 min em RT.
- Ressuspenda o pellet de microvasos em 10 mL de DMEM/F12 suplementado com 20% de soro derivado de plasma pobre em plaquetas bovinas, fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF, 2 ng/mL), heparina (100 μg/mL), gentamicina (50 μg/mL) e HEPES (2,5 mM), denominado meio de células endoteliais (MEC) suplementado com puromicina a 4 μg/mL.
- Retire os 2 frascos T75 revestidos da incubadora, aspire o excesso de revestimento e coloque os microvasos de cada tubo em um frasco T75 (microvasos extraídos de 1,5 córtex por frasco T75).
