Barreira hematoencefálica ou modelo BBTB: uma adaptação da barreira hematoencefálica ou modelo BBB para avaliar a administração terapêutica ao tumor

Resumo

Fonte: Le Joncour, V. et al. Prevendo a entrega de cargas úteis in vivo usando uma barreira de tumor hematoencefálico em um prato. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, descrevemos um protocolo abrangente para estabelecer um modelo in vitro que imita a barreira hematoencefálica. O modelo promete entender a entrega de agentes terapêuticos para o tratamento de tumores cerebrais.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Estabelecimento dos BBTB Mimics

NOTA: O meio de cultura celular e os suplementos são detalhados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de Astrócitos
   nota: Os volumes a seguir indicados são adequados para uma placa de Petri de 10 cm ou um balão de cultura de células T75.
   1. Sob uma capa de cultura de células estéril, lave cuidadosamente os astrócitos cultivados com 5 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). Descarte cuidadosamente o PBS usando uma bomba de vácuo e adicione 2 mL do reagente de dissociação celular por 5 min (a 37 ° C, consulte a Tabela de Materiais) para separar as células. Verifique o descolamento da célula sob o microscópio. Não exceda 5 min de incubação para limitar o estresse nas células.
   2. Adicione 10 mL de meio de cultura de células de astrócitos completos estéreis (ABM+) ao recipiente para inibir a atividade do reagente de dissociação celular. Use uma pipeta sorológica estéril para transferir as células destacadas do vaso para um tubo estéril de 15 mL. Centrifugar a suspensão da célula durante 3 min a 250 rcf (aceleração: 9 rcf/s, desaceleração: 5 rcf/s) à temperatura ambiente (RT).
   3. Enquanto isso, prepare as inserções (consulte a Tabela de Materiais): Usando uma pinça estéril, coloque as inserções com o lado do cérebro para cima (Figura 1A) na tampa de uma placa estéril de 6 poços (Figura 1B). Verifique previamente se a placa pode ser colocada de cabeça para baixo sobre as pastilhas sem tocar ou mover as pastilhas durante o processo.
      NOTA: A colocação adequada das inserções permite o aprisionamento da suspensão de astrócitos entre a membrana e o fundo do poço.
   4. Uma vez centrifugado, descarte cuidadosamente o sobrenadante da suspensão celular; ressuspenda o pellet de astrócitos em 1 mL de ABM+, ressuspendendo suavemente o pellet na parede do tubo em até 5x. Evite a pipetagem excessiva das células para limitar o estresse nas células. Conte as células e ajuste a densidade da suspensão celular para 1,5 x 10⁵ células em 400 μL de ABM+/inserto.
   5. Coloque a suspensão celular no meio do lado do cérebro da membrana da inserção (Figura 1B) e, com muito cuidado, espalhe-a usando força capilar com uma ponta de pipeta estéril. Evite o contato direto, pois a membrana é particularmente frágil.
   6. Com o lado do cérebro das inserções ainda para cima, coloque a placa de 6 poços de volta nas inserções. Isso garante que a suspensão celular fique presa entre a membrana e o fundo real do poço ( Figura 1C ). Evite bolhas de ar na suspensão celular, pois isso impedirá a propagação homogênea dos astrócitos na membrana.
   7. Colocar a placa e as inserções, com o cérebro voltado para cima, na incubadora (a 37 °C com 5% de CO₂) para permitir a adesão celular por um período mínimo de 2 h (astrócitos murinos imortalizados) e até 6 h (astrócitos primários humanos).
      NOTA: Como as inserções são mantidas de cabeça para baixo, a visualização da adesão celular não é possível ao microscópio. Recomenda-se, portanto, semear um vaso de cultura de células regular separado e controlar a adesão celular no vaso ao longo do tempo. A manipulação cuidadosa da membrana é uma obrigação, pois os resultados não serão confiáveis quando as membranas forem danificadas.
   8. No final do tempo de incubação, verifique a ausência de fugas em suspensão celular fora da área de sementeira e elimine as inserções se estiverem com fugas. Reverta a placa de 6 poços para sua posição normal, com inserções que agora terão o lado do sangue para cima (Figura 1A). Adicione 2,6 mL de ABM+ a cada poço. Despeje 2,5 mL de meio astrócito completo em cada inserto e coloque a placa na incubadora (a 37 ° C com 5% de CO₂).

2. Preparação de Células Endoteliais

NOTA: Para as células endoteliais microvasculares do cérebro murino (bEND3), as células devem atingir 100% de confluência para garantir contatos máximos célula-célula, desencadeando a expressão ideal da proteína de junção apertada no dia do experimento. Isso não se aplica às células endoteliais da veia umbilical humana (HuAR2T), pois a presença de astrócitos é necessária para a expressão da proteína de junção apertada para essas células.

1. Proceda como descrito anteriormente para os astrócitos para dissociação celular. Depois de centrifugado, descarte cuidadosamente o sobrenadante; ressuspenda o pellet de células endoteliais em 1 mL de meio de cultura de células endoteliais completo (EBM+) pipetando lentamente a suspensão celular na parede do tubo em até 5x. Evite a pipetagem excessiva das células para limitar o estresse nas células. Conte as células e ajuste a densidade da suspensão celular para 2 x^10,5 células em 2,5 mL / inserção de meio de cultura de células endoteliais desprovido de soro (EBM-) e fator de crescimento endotelial vascular-A (VEGF-A).
2. Retire a placa que contém as inserções, descarte cuidadosamente o meio do lado do sangue e substitua-o por 2,5 mL da suspensão de células endoteliais. Retorne a placa para a incubadora (a 37 ° C com 5% de CO₂) e deixe-a durante a noite para que as células endoteliais adiram à membrana.
3. No dia seguinte, prepare uma placa estéril de 6 poços transferindo 3 mL de meio de astrócitos sem soro pré-aquecido (ABM-) para cada poço. Manuseando as inserções com pinça estéril, descarte cuidadosamente o meio endotelial completo do lado do sangue, coloque a inserção na nova placa contendo ABM- e adicione 2,5 mL de EBM-.
   nota: O uso de MBE- é fundamental para o estabelecimento da barreira endotelial.
4. Deixe as inserções na incubadora (a 37 °C com 5% de CO₂) com o mínimo de perturbação física e variações de temperatura por 5 dias, permitindo a produção da membrana basal endotelial, contatos de astrócitos com células endoteliais e, eventualmente, a formação de imitação de BBTB. Substituir o meio no dia da transferência para as culturas de células de glioma.

3. Preparação de células de glioma

NOTA: Embora as esferas de glioblastoma derivadas do paciente sejam usadas aqui, o protocolo a seguir pode ser facilmente adaptado para células de glioblastoma aderentes e disponíveis comercialmente, como o U-87MG.

1. Opcionalmente, para imagens de imunofluorescência, coloque até quatro lamínulas redondas estéreis de borossilicato (ø 0,9 cm) por poço em uma placa de 6 poços contendo 2 mL de poli-D-lisina (0,01%). Incubar em temperatura ambiente por 30 min.
2. Enquanto isso, transfira cuidadosamente as esferas tumorais do vaso de cultura de células para um tubo estéril de 15 mL usando uma pipeta sorológica estéril. Centrifugue as esferas tumorais por 3 min a 250 rcf.
3. Descarte o sobrenadante, ressuspenda suavemente as esferas em 1 mL de meio celular de glioma livre de bFGF / EGF (GBM-) e conte as células. Ajuste a densidade da célula para aproximadamente 10⁴ esferas/mL (10⁵ células/mL) em GBM-.
4. Descarte a poli-D-lisina dos poços e enxágue-os 3x com PBS estéril. Semeie a placa com 3 mL / poço da suspensão esferóide tumoral e transfira as inserções com o imitador BBB na suspensão de células tumorais.
5. Incubar durante a noite (a 37 °C com 5% de CO₂) para permitir o equilíbrio entre os lados do sangue e do tumor cerebral do ensaio. No dia seguinte, substitua o meio no lado do sangue por EBM- suplementado com as moléculas/fármacos/nanopartículas de interesse. As amostras são coletadas ao longo do tempo para quantificação direta, conforme descrito na seção anterior. As células são fixadas em um ponto de tempo preciso para imagens de fluorescência.

Resultados

Figura 1: Descrição do modelo de barreira hematoencefálica (BBTB).(A) Representação esquemática das localizações de diferentes tipos de células. (B) Ilustração da colocação do inserto na tampa da placa de 6 poços e a técnica de semeadura para os astrócitos no lado do cérebro da membrana do inserto. (C) Ilustração da colocação da placa de 6 poços permitindo a adesão dos astrócitos. (

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células
bEND3	ATCC	CRL-2299	Cultivado em: DMEM (1g/L de glicose) suplementado com 10% de FBS- 5 mL de L-glutamina e 5 mL de penicilina/estreptomicina
HIFko imortalizou astrócitos de camundongos	Isolado no Laboratório Dr. Gabriele Bergers	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	Cultivado em: BME-1 suplementado com 5% de FBS- 5 mL 1 M HEPES-5 mL 100 mM de piruvato de sódio- 3 g de D-glicose e 5 mL de penicilina/estreptomicina
HuAR2T	Isolado no laboratório da Dra. Dagmar Wirth	https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184	Cultivado em: EBM-2 com astrócitos primários humanos normais SupplementMix Lonza CC-2565 Cultivado em: ABM com SingleQuots
Material e reagentes
100 mm x17 mm Prato Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	Rolamento 150350
10 mL de pipeta sorológica	ThermoFisher Scientific	170361
Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno estéril de 15 mL	ThermoFisher Scientific	Rolamento 339650
ABM Meio Basal 500 mL	Lonza	CC-3187	Para astrócitos humanos primários. ABM+: contém todos os aditivos da mistura de suplementos. ABM-: todos os aditivos, exceto rhEGF e FBS
Solução de descolamento de células Accutase	Corning	25-058-CI
AGM SingleQuots Suplementos e fatores de crescimento	Lonza	CC-4123
Suplemento B27	Gibco	Rolamento 17504-044	Para GBM + e - médio
Águia média basal	ThermoFisher Scientific	21010046	BME-1
Placas de 6 poços tratadas com Corning Costar TC	Sigma-Aldrich	CLS3506
Inserções de cultura de células de membrana de poliéster Corning Transwell	Sigma-Aldrich	CLS3452
D-glicose	Sigma-Aldrich	G8270	Dissolva em 50 mL de BME-1 e filtro estéril antes de adicionar ao meio
Presunto F-12 Médio/Nutriente de Águia Modificado Dulbecco's	Gibco	Rolamento 21331-020	Específico para a cultura das esferas derivadas de pacientes isoladas em nosso laboratório; pode variar para outras linhagens celulares de glioma
EBM-2 crescimento Médio SupplementMix	PromoCell	C-39216	EBM+: contém todos os aditivos da mistura de suplementos. EBM-: todos os aditivos, exceto VEGF-A e FBS
Meio Basal Endotelial 2 (EBM-2)	PromoCell	C-22211	EBM+: contém todos os aditivos da mistura de suplementos. EBM-: todos os aditivos, exceto VEGF-A e FBS
Soro fetal bovino (FBS), qualificado, inativado por calor, aprovado pela UE Origem na América do Sul	ThermoFisher Scientific	10500056
Sal de sódio fluoresceína	Sigma-Aldrich	F6377
Placas de 96 poços Greiner CELLSTAR	Sigma-Aldrich	Greiner 655090	Poços de poliestireno preto fundo plano (com fundo microtransparente)
Menzel-Gläser 0,9 cm redondo borossilicato Lamínulas	Thermo Científico	10313573
Comprimidos PBS	Medicago	09-9400-100	Um comprimido por litro de dH2O; em seguida, esterilizar a solução em autoclave
Bromidrato de poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	Pág. 6407
EGF humano recombinante	Peprotech	GMP100-15	Para GBM+ médio
FGF-básico humano recombinante (154 a.a.)	Peprotech	100-18B	Para GBM+ médio