Ensaio de permeabilidade mimetizada da barreira hematoencefálica: um ensaio in vitro para avaliar a permeabilidade do BBB Mimic a moléculas traçadoras

Resumo

Fonte: Le Joncour, V. et al. Prevendo a entrega de cargas úteis in vivo usando uma barreira de tumor hematoencefálico em um prato. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo descreve um ensaio de permeabilidade para avaliar a permeabilidade da barreira hematoencefálica in vitro usando moléculas de fluoresceína de sódio.

Protocolo

1. Medição da permeabilidade mímica BBTB
   

   1. A difusão passiva do corante fluorescente de pequeno peso molecular sódio-fluoresceína (Na-Fl) ao longo do tempo do sangue para o lado do cérebro das inserções permite o cálculo dos valores de permeabilidade de acordo com a seguinte fórmula:
      Aqui, dFwell é o valor de fluorescência medido no poço em um determinado ponto de tempo menos o valor de autofluorescência do meio de cultura de células, dT é o tempo em segundos, A é a superfície da barreira em centímetros quadrados e dFinsert é o valor de fluorescência medido no inserto no mesmo ponto de tempo menos o valor de autofluorescência do meio).
   2. Colete 100 μL do meio dos lados do sangue e do cérebro do imitador BBTB e transfira cada um deles para uma placa preta de fundo plano separada de 96 poços para medições de fluorescência subsequentes. Use a mídia simples como espaço em branco para corrigir a autofluorescência.
   3. Prepare 2,5 mL por poço de Na-Fl (50 μM) em EBM-. Pré-aqueça a solução de Na-Fl a 37 °C. Substitua o meio do lado do sangue das inserções pelo meio contendo Na-Fl. Inicie um cronômetro assim que o meio for substituído.
   4. Colete cuidadosamente 100 μL de meio do lado do sangue e do cérebro das inserções em 5, 30, 60 e 120 min. Transfira cada amostra para poços separados da placa preta de 96 poços.
   5. Assim, substitua a mídia coletada dos insertos para manter o equilíbrio de volume entre os dois lados. Coloque as inserções de volta na incubadora entre cada coleta de amostra para minimizar as variações de temperatura.
   6. Quantificar a fluorescência das amostras coletadas, utilizando um leitor de placas com o filtro ajustado em 480/560 nm (excitação e emissão, respectivamente).
      nota: A fluorescência do lado do cérebro é quase indetectável no ponto de tempo de 5 minutos. Valores altos em comparação com o blank indicam vazamento/dano à membrana do inserto ou à barreira; portanto, exclua-os de análises posteriores. Os valores esperados de permeabilidade Na-Fl para o BBTB devem estar na faixa de 10–5 a 10–6 cm/s (Tabela 1).

Tabela 1: Valores da permeabilidade sódio-fluoresceína (Na-Fl) (em centímetros por segundo) determinados in vitro nos sistemas de co-cultura indicados e in vivo em camundongos nus NMRI. Dados de um experimento representativo (n = 3 camundongos).

Mímica murina BBTB	bEND3	bEND3+HIFko As	bEND3+GB	bEND3+HIFko As+GB	in vivo
Permeabilidade (10–6 cm/s)	27.63	6.74	26.8	10.83	5.57
DP (10–6 cm/s)	3.45	3.01	7.99	2,65	2.19
Mímica BBTB humana	HuAR2T	HuAR2T+hIAs	HuAR2T+GB	HuAR2T+hIAs+GB
Permeabilidade (10–6 cm/s)	104,92	47.4	89.08	48.24
DP (10–6 cm/s)	27.1	14.32	10.21	13.07

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Material e reagente
10 mL de pipeta sorológica	ThermoFisher Scientific	170361
ABM Meio Basal, 500 mL	Lonza	CC-3187	Para astrócitos humanos primários. ABM+: contém todos os aditivos da mistura de suplementos. ABM-: todos os aditivos, exceto rhEGF e FBS
Águia média basal	ThermoFisher Scientific	21010046	BME-1
Presunto F-12 Médio/Nutriente de Águia Modificado Dulbecco's	Gibco	Rolamento 21331-020	Específico para a cultura das esferas derivadas do paciente isoladas em nosso laboratório, pode variar para outras linhagens celulares de glioma
Placas de 96 poços Greiner CELLSTAR S	Sigma-Aldrich	Greiner 655090	Poços de poliestireno preto fundo plano (com fundo microtransparente)
Sal de sódio fluoresceína	Sigma-Aldrich	F6377
Leitor de microplacas FLUOstar Omega	BMG Labtech
Células
bEND3	ATCC	CRL-2299	Cultivado em: DMEM (1g/L de glicose) suplementado com 10% de FBS, 5 mL de L-glutamina e 5 mL de penicilina/estreptomicina
HIFko imortalizou astrócitos de camundongos	Isolado no Laboratório Dr. Gabriele Bergers	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	Cultivado em: BME-1 suplementado com 5% de FBS, 5 mL de HEPES 1 M, 5 mL de piruvato de sódio 100 mM, 3 g de D-glicose e 5 mL de penicilina/estreptomicina
HuAR2T	Isolado no laboratório da Dra. Dagmar Wirth	https://doi.org/10.1089/ ten.tea.2009.0184	Cultivado em: EBM-2 com SupplementMix
Astrócitos primários humanos normais	Lonza	CC-2565	Cultivado em: ABM com SingleQuots