Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Homogeneização
NOTA: Todas as etapas são executadas a 4 °C.
- Adicionar 1,5 mL de Tricaine (15 mM) a placas de Petri de 90 mm contendo 50 larvas em 50 mL de meio embrionário E3 tratado com PTU de 200 μM para anestesiar terminalmente.
- Sugue 10 larvas anestesiadas das placas de Petri com uma pipeta de plástico Pasteur de 3 mL.
- Transfira as larvas anestesiadas 10 por 10 para uma placa de Petri de 55 mm cheia de meio embrionário E3 gelado + Tricaína.
- Sob um estereomicroscópio, alinhe 10 larvas no centro da placa de Petri. Em seguida, faça o transecto das cabeças larvais acima do saco vitelino usando uma microtesoura cirúrgica (exclua a bexiga natatória para evitar cabeças flutuantes).
- Sugue as cabeças das placas de Petri com uma pipeta de plástico Pasteur de 3 mL. Aguarde até que todos os cabeçotes se acumulem na ponta da pipeta e, em seguida, transfira-os para um homogeneizador de vidro contendo 1 mL de meio A gelado (transfira em um volume mínimo para reduzir a diluição do meio A por E3 + Tricaína). Mantenha o homogeneizador de vidro no gelo. Use um homogeneizador por condição experimental.
- Substitua cada pequena placa de Petri contendo E3 + Tricaína gelada por uma nova a cada 30 minutos para garantir que a transecção seja realizada em meio E3 + Tricaína frio.
- Substitua a mídia gelada A no homogeneizador de vidro quando a cor começar a desbotar.
NOTA: A diluição do meio A pode alterar o tecido da cabeça devido a mudanças de temperatura.
- Uma vez que todos os cabeçotes tenham sido coletados (600 cabeças/condição), remova o volume máximo de mídia A do homogeneizador de vidro e substitua-o por 1 mL de mídia A gelada fresca.
- Interrompa o tecido cerebral com um homogeneizador de vidro apertado no gelo. Execute 40 rodadas de esmagamento e voltas para larvas de 3–5 dpf e 50 para larvas de 7 e 8 dpf.
- Adicionar 2 mL de meio A à suspensão celular (1 mL de meio A/200 cabeças), que irá diluir as células e reduzir sua aglomeração com mielina para facilitar sua separação durante a centrifugação em meio de gradiente de densidade.
- Para eliminar a aglomeração celular, passe a suspensão celular por um filtro de células de 40 μm colocado em cima de um tubo de falcão frio de 50 mL mantido em gelo. Repita esta operação 3 vezes.
- Transfira 1 mL de suspensão celular para tubos frios de 1,5 mL e gire-os a 300 g por 10 min a 4 ° C.
- Remova o sobrenadante usando uma seringa de 10mL + agulha 23G x 1''.
- Ressuspenda o pellet celular com 1 mL de meio de gradiente de densidade de 22% gelado suavemente sobreposto por 0,5 mL de DPBS gelado 1x (não os misture, uma interfase entre as duas soluções será vista).
- Tubos de rotação a 950 g sem freio e aceleração lenta por 30 min a 4 °C.
NOTA: Esta etapa separa a mielina de outras células, sequestrando-a na interfase do meio de gradiente de densidade DPBS 1x e 22%, enquanto as células serão pellet no fundo do tubo. A remoção de mielina é mais eficiente quando a concentração de células não é muito alta.
- Usando uma seringa de 10 mL + agulha 23G x 1'', descarte o máximo de DPBS, meio gradiente de densidade e mielina presa em sua interfase.
- Lave as células com 0,5 mL de meio A + 2% de soro de cabra normal (NGS) e, em seguida, gire os tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C.
- Rejeitar o máximo do sobrenadante e, em seguida, agrupar todos os sedimentos celulares da mesma condição experimental em 1 ml de meio A + 2% de NGS.
- Se as células de interesse expressarem macrófagos/microglia semelhantes a proteínas fluorescentes de mpeg1:eGFP ou neurônios de peixes transgênicos NBT:DsRed, passe a suspensão celular por uma tampa de filtro de células de 35 μm e transfira-as para tubos FACS frios de 5 mL em gelo, protegidos da luz.
NOTA: Alternativamente, a imunocoloração da microglia pode ser realizada.