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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Imunocoloração da Microglia
NOTA: Todas as etapas são executadas a 4 °C.
- Ressuspenda o pellet celular obtido de células de cultura cerebral com 0,3 mL de Meio A + 2% de soro de cabra normal ou NGS. Divida-os em 3 tubos de 1,5 mL: um para células não coradas para medir a autofluorescência das células de interesse, segundo para o anticorpo secundário (1/200) para medir a ligação não específica do anticorpo secundário à microglia e terceiro como teste (anticorpo monoclonal de camundongo 4C4 (específico da microglia) (1/20) + anticorpo secundário (1/200)).
- Adicione Baixa Endotoxina, Livre de Azida (LEAF) a 1% às células (todos os tubos) para bloquear as interações CD16/CD32 com o domínio Fc das imunoglobulinas. Incube as células por 10 min com agitação suave a cada 5 min.
- Adicione o anticorpo 4C4 (1/20) às células (tubo 3) e incube por 30 min com agitação suave a cada 10 min.
- Centrifugar os tubos a 300 g durante 10 min a 4 °C e, em seguida, rejeitar o sobrenadante.
- Lave uma vez com 0,5 mL de meio A + 2% NGS e, em seguida, gire os tubos a 300 x g por 10 min a 4 ° C.
- Ressuspenda o pellet celular com 0,5 ml de Meio A + 2% NGS e incube as células com LEAF a 1% por 10 min com agitação suave a cada 5 min.
- Adicione anticorpo secundário (1/200) às células (tubo 2 e 3). Incube as células por 30 min com agitação suave a cada 10 min e proteção leve.
- Centrifugar os tubos a 300 g durante 10 min a 4 °C e, em seguida, rejeitar o sobrenadante.
- Lave duas vezes com 0,5 mL de meio A + 2% NGS e, em seguida, ressuspenda o pellet celular com 1 mL de meio A + 2% NGS.
- Passe a suspensão de células através de uma tampa de filtro de células de 35 μm e transfira-as para uma classificação de células ativada por fluorescência de 5 mL a frio ou tubos FACS no gelo, protegidos da luz.
2. Classificação de células (FACS)
NOTA: Execute todas as etapas a 4 °C.
- Classifique neurônios, macrófagos/microglia e microglia usando um FACS.
NOTA: Esta etapa geralmente é realizada por um membro da equipe da instalação FACS e as configurações dependem do tipo de equipamento usado.
- Adicione DAPI a uma concentração de 1 μg/mL em cada tubo FACS para marcar as células mortas.
- Configure o FACS e classifique neurônios, macrófagos/micróglia ou microglia de todas as células cerebrais. Separe as células dos detritos em função de seu tamanho e granularidade e, em seguida, bloqueie as células únicas por dispersão direta e lateral. Exclua células mortas por marcação DAPI de células vivas. Identifique neurônios, macrófagos/microglia ou microglia por suas respectivas colorações positivas.
- Colete células em tubos de 1,5 mL contendo 1 mL de meio A gelado + 2% de NGS no gelo. Use tubos diferentes para cada tipo de célula.
- Centrifugar os tubos a 300 x g durante 10 min a 4 °C e rejeitar em seguida o sobrenadante.
- Lave uma vez com 0,5 mL de Meio A e descarte o máximo de sobrenadante.