Nocaute de gene mediado por RNA de grampo curto em iHSPCs in vitro: um sistema de expressão de shRNA baseado em lentivírus em iHSPCs para knockdown de expressão gênica específica

Resumo

Fonte: Hsiao, Y. L., et al. Estudo do Desenvolvimento de Células Dendríticas por Nocaute de Gene Mediado por RNA em um Tronco Hematopoiético e Linha Celular Progenitora In vitro. J. Vis. Exp. (2022).

Neste vídeo, demonstramos um método para realizar a transdução de vetores lentivirais shRNA para obter linhagens celulares knockdown estáveis em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas (iHSPCs).

Protocolo

1. Preparação de linhagens celulares hematopoiéticas imortalizadas e progenitoras (iHSPCs)

1. Manter a linhagem celular iHSPC em meio RPMI 1640 completo contendo 100 ng/mL FL e 1 μM de β-estradiol.
2. Passe as células na proporção de 1:10 a cada 3 dias.
   nota: Faça o meio RPMI 1640 completo suplementando com 10% de soro fetal bovino (FBS), 5 ^x10-5 M β-mercaptoetanol e 10 μg / mL de gentamicina. O FL murino recombinante também está disponível comercialmente.

2. Transdução lentiviral

1. Placas iHSPCs com densidade de 1 x 10⁵ células/poço em placas de 12 poços em 1 mL de meio completo contendo 100 ng/mL FL, 1 μM de β-estradiol e 8 μg/mL de polibreno.
   nota: A concentração de polibreno depende dos tipos de células e geralmente está na faixa de 4-8 μg/mL.
2. Adicione lentivírus portador de shRNA em cada poço em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100,
   nota: O vetor lentiviral é pLKO.1-Puro com um marcador de seleção de puromicina (Figura 1). As sequências alvo de shRNAs contra LacZ, Tcf4 e Id2, respectivamente, estão listadas na Tabela de Materiais. O MOI é definido pelo número de vírions que são adicionados por célula durante a infecção.
   
3. Gire as placas a 1.100 x g por 90 min a 37 °C.
4. Incubar a placa contendo células infectadas durante a noite a 37 °C em uma incubadora.
   nota: Se as células forem sensíveis ao polibreno, atualize as células com o meio completo sem polibreno após a infecção por spin.
5. Refresque as células com meio completo contendo 100 ng/mL FL e 1 μM de β-estradiol 24 h após a infecção.
6. Adicione 6 μg/mL de puromicina ao meio para selecionar as células infectadas após um adicional de 24 h.
   nota: O vetor lentiviral transduzido geralmente leva 48 h para expressar genes, incluindo o gene resistente à puromicina. Certifique-se de que a concentração de puromicina seja otimizada para cada linha celular.
7. Atualize o meio de seleção contendo 100 ng/mL FL, 1 μM de β-estradiol e 6 μg/mL de puromicina a cada 3 dias e mantenha as células por pelo menos uma semana para expandir as células iHSPC transduzidas de forma estável.
   nota: A seleção de puromicina geralmente entra em vigor 48 h depois, e o período de seleção depende dos tipos de células.

Resultados

Figura 1: A construção do vetor lentiviral pLKO.1-Puro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microtubo de 1,5 mL	ExtraGene	TUBO-170-C
Placa tratada com cultura de tecidos de 12 poços	falcão	353043
Soro fetal bovino (FBS)	Corning	35-010-CV
RPMI 1640 médio	Gibco	11875-085
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758-250MG
β-mercaptoetanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250
Ligante Flt3 (FL)	Feito em casa
Polibreno	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
Puromicina	Invivogen	formiga-pr-1
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	O Consórcio RNAi (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	O Consórcio RNAi (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	O Consórcio RNAi (TRC)