Edição do genoma CRISPR tudo-em-um: um método para knock-in de gene baseado em reparo dirigido por homologia em células cultivadas usando o sistema CRISPR-Cas9

Resumo

Fonte: Zhang, L. et al, Gene Knock-in por CRISPR/Cas9 e Classificação de Células em Macrófagos e Linhas de Células T. J. Vis. (2021).

Neste vídeo, demonstramos a edição completa do genoma baseada em CRISPR-Cas9 em células cultivadas, onde Cas9 e sgRNA são fornecidos como uma única construção de plasmídeo para as células. O sistema CRISPR-Cas9 e o gene desejado a ser inserido foram introduzidos nas células por meio da técnica de eletroporação para facilitar a edição gênica bem-sucedida.

Protocolo

1. Eletroporação de Linhagens de Macrófagos e Células T

1. Preparar culturas de células para eletroporação
   1. Prepare o Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) como meio de crescimento completo para células T Jurkat. Prepare o Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de FBS para cultura de macrófagos RAW264.7. Suplementar todos os meios de crescimento completos com 100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina (Caneta / Estreptococos), exceto os meios usados para incubação pós-transfecção antes da classificação das células.
   2. Realize a subcultura de células T RAW264.7 e Jurkat de acordo com as instruções do fornecedor (consulte a Tabela de Materiais). Ao subcultivar células RAW264.7, use solução de tripsina-EDTA (0,25%) para separar as células. Use FBS suplementado com 10% (v / v) de DMSO como meio de criopreservação para células RAW264.7 e Jurkat.
   3. Colete células a 250 × g por 5 min para macrófagos RAW264.7 e 90 × g por 8 min para células T Jurkat. Em seguida, lave com 5-10 mL de 1× DPBS (sem íons Ca²⁺ ou Mg²⁺). Remova o DPBS.
   4. Ressuspenda o pellet celular usando 2 mL de 1× DPBS. Use 10 μL de células e misture com um volume igual de azul de tripano a 0,2% para estimar a contagem e a viabilidade das células.
      nota: Certifique-se de que a cultura celular tenha viabilidade de >90% no dia da transfecção.
   5. Para um único experimento knock-in, execute a eletroporação com pontas de nucleofecção de 10 μL com cinco repetições. Calcule o volume necessário para 2,0 × 106 células e peletize as células por centrifugação. Lave o pellet celular novamente com 1× DPBS conforme descrito na etapa 1.1.2.
      nota: Ao usar pontas de nucleofecção de 10 μL, são necessárias 4,0 × 10⁵ células por eletroporação. Assim, prepare pelo menos 2,0 × 10⁶ células para um experimento knock-in.
   6. Preparar uma placa de 24 poços com 0,5 ml de meio de crescimento completo (preparado no passo 1.1.1) por alvéolo sem Pen/Strep e pré-aquecer numa incubadora a 37 °C.

2. Eletroporação de componentes CRISPR/Cas9 e o vetor de direcionamento

1. Ligue o sistema de eletroporação. Use parâmetros de eletroporação otimizados da seguinte forma: 1.400 V/20 ms/2 pulsos para macrófagos RAW264.7 e 1350 V/20 ms/2 pulsos para células T Jurkat.
2. Levando em conta a perda de amostra devido à pipetagem, prepare uma mistura de eletroporação de 55 μL em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL contendo 2,5 μg de cada vetor CRISPR/Cas9 (pDsR-mR26-sg1 e pDsR-mR26-sg2 para knock-in do locus mRosa26 e pDsR-hR26-sg1 e pDsR-hR26-sg2 para o locus hROSA26), 2,4 μg do vetor de direcionamento linearizado (pKR26-POI-iBFP ou pKhR26-POI-iBFP para mRosa26 e hROSA26knock-in, linearizado por EcoRI ou BamHI), e o tampão de ressuspensão R.
   nota: Para economizar tempo, a mistura de eletroporação pode ser preparada durante a centrifugação (etapa 1.1.5).
3. Ressuspenda 2,0 × 10⁶ células (preparadas na etapa 1.1.5) na mistura de eletroporação de 55 μL da etapa 1.2.2.
4. Aspire a mistura de célula / eletroporação da etapa 1.2.3 usando uma ponta de nucleofecção de 10 μL com uma pipeta.
   nota: Durante a pipetagem, evite introduzir bolhas de ar, que podem causar falha na eletroporação.
5. Adicione a amostra a um tubo cheio de 3 mL de tampão E do kit de eletroporação.
6. Aplique os parâmetros de eletroporação para os dois tipos de células, conforme descrito na etapa 1.2.1.
7. Transferir a amostra para um alvéolo da placa de 24 poços com meio pré-aquecido do passo 1.1.6.
8. Repita as etapas 1.2.4-1.2.7 para as outras quatro repetições, bem como para os controles somente vetor de direcionamento e somente vetor de expressão CRISPR.
   nota: Troque a ponta e o tubo de nucleofecção ao mudar para um tipo de célula/DNA de plasmídeo diferente.
9. Cultive as células transfectadas por 48-72 h para permitir a recuperação após eletroporação e expressão de componentes CRISPR/Cas9 antes da análise de citometria de fluxo ou classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ampicilina, sal de sódio	MP Biomédicos	194526
Celômetro Mini Contador de Células Automatizado	Nexcelom Biociência
DPBS (10X), sem cálcio, sem magnésio	ThermoFisher Scientific	14200075
Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose	HyClone	SH30022.01
Tubo de ensaio de fundo redondo de poliestireno Falcon 5 ml	BD Biociências	352003
Soro fetal bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	10099141
Jurkat	ATCC	TIB-152	https://www.atcc.org/
Sulfato de canamicina	MP Biomédicos	194531
Pipeta multicanal (30-300 μL)	Eppendorf, ou similar
Sistema de transfecção de néon	ThermoFisher Scientific	MPK5000
Sistema de transfecção de néon, kit de 10 μL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Tubos de centrífuga estéreis cônicos Nunc 15 mL	ThermoFisher Scientific	339651
Ponteira de pipeta 0,1-20μl	Eppendorf, ou similar	Nº 0030 075.005
Ponteira de pipeta 2-200μl	Eppendorf, ou similar	Nº 0030 075.021
Ponteira de pipeta 50-1000μl	Eppendorf, ou similar	Nº 0030 075.064
pX458-DsRed2	Addgene	112219
RAW264.7	ATCC	TIB-71	https://www.atcc.org/
RPMI 1640 Médio	HyClone	SH30027.01
Penicilina-estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
Solução de Azul de Tripano, 0,4%	ThermoFisher Scientific	15250061
Microtubos de 1,5 mL, PCR limpo	Eppendorf, ou similar	0030 125.215
Placas de poços múltiplos tratadas com TC transparente de 24 poços	Corning	3524