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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Prepare células-tronco para edição
- Cultive e cultive células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em uma placa de 6 poços contendo 2,4 × 106 células/placa de alimentadores de fibroblastos embrionários de camundongo (MEF) inativados com mitomicina C cultivados em gelatina. Manter hPSCs em 3 ml de meio de células-tronco embrionárias humanas por poço (meio hESC) e crescer em uma incubadora a 37 °C com 3% de O2/5% CO2.
nota: Para o sucesso deste protocolo, não é necessário manter as hPSCs em uma incubadora com baixo teor de oxigênio; no entanto, é importante observar que as hPSCs proliferam mais rapidamente em um ambiente de alto O2, portanto, os tempos e o número de células devem ser ajustados de acordo. Deve-se notar também que as hPSCs mantidas em baixo oxigênio têm taxas mais baixas de diferenciação espontânea.
- Para fazer 500 ml de mídia hESC, combine 380 ml de DMEM/F12, 75 ml de soro fetal bovino (FBS), 25 ml de reposição de soro knockOut (KSR). Adicione Glutamina (concentração final de 1 mM), 5 ml de aminoácidos não essenciais 100x, 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina (P/S), fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) (concentração final de 4 ng/ml) e 2-mercaptoetanol (concentração final de 5,5 μM).
- Troque a mídia removendo todo o volume da mídia (3 ml) usando uma pipeta de vidro e aspire. Substitua por 3 ml de meio quente de hESC usando uma pipeta sorológica. Repita a mudança de mídia todos os dias até que as hPSCs estejam aproximadamente 50% confluentes (Dia 1).
- Um dia antes do direcionamento (Dia 1), troque o meio hESC, removendo o meio antigo e adicionando meio hESC quente suplementado com 10 μM Y-27632.
- Também no Dia -1, prepare uma a duas placas de 6 poços ou 10 cm de células alimentadoras de MEF resistentes a medicamentos de camundongos DR4 (2,4 × 106 células/placa).
Nota: Em geral, placas de 6 poços são vantajosas em relação às placas de 10 cm, pois acomodam mais meios. As placas de 6 poços também garantem que diferentes clones de diferentes poços sejam independentes. No entanto, uma placa de 10 cm permitirá uma colheita mais fácil, dependendo do microscópio disponível para este processo.
2. Edição de células-tronco pluripotentes
- Prepare as soluções de transfecção pipetando 5 μg de ZFN 1 e 2 (Figura 1) em um tubo de 1,5 ml. Pipetar também 30 μg do plasmídeo de reparação para este tubo. Por fim, pipete 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) no tubo para elevar o volume até 300 μl.
nota: Preparar plasmídeos como um midiprep (qualquer kit é adequado) com uma concentração mínima de 300 ng/μl para manter o volume total da solução de transfecção abaixo de 300 μl. Não é necessário realizar a extração de fenol/clorofórmio, linearizar o plasmídeo ou usar um kit de preparação de plasmídeo livre de endotoxina.
- Remova a mídia dos hPSCs usando uma pipeta de vidro e aspire. Pipete 2 ml de PBS quente 1x em cada poço para lavar as células.
- Remova o PBS imediatamente usando uma pipeta de vidro e aspire. Adicione 0,5 ml de solução de tripsina-EDTA a 0,25% diretamente nas células de cada poço. Coloque na incubadora (37 °C/5% CO2/3% O2) por aproximadamente 10 min. ou até que a camada de alimentação comece a se soltar da placa.
- Adicione 2 ml de meio esWash quente (470 ml DMEM/F12, 25 ml FBS, 100 unidades/ml P/S) a cada poço para interromper a reação de tripsina.
- Certifique-se de que as células do alimentador saiam como uma folha. Pipetar o conteúdo de cada alvéolo para um único tubo cónico de 50 ml, combinando todos os alvéolos. Triturar as células com uma pipeta serológica de 10 ml. Não é necessário quebrar a camada do alimentador; Os hPSCs sairão da camada alimentadora por trituração suave. Deve haver cerca de 15 ml da suspensão celular.
- Adicione 25 ml de meio esWash ao tubo para aumentar o volume para 40 ml no total. Deixe grandes pedaços do alimentador assentarem no fundo do tubo por 1-2 min. Remova o sobrenadante (~ 38 ml) do tubo usando uma pipeta sorológica e deposite em um novo tubo cônico de 50 ml.
- Gire para baixo por 5 min a 190 x g. Remova o sobrenadante do tubo usando uma pipeta de vidro e aspire. Certifique-se de não perturbar o pellet da célula. Ressuspenda as células em 500 μl 1x PBS. Combine com a solução de transfecção de plasmídeo preparada anteriormente. Conte as células nesta etapa. Use 5-10 milhões de células por eletroporação.
- Pipetar toda a suspensão de 800 μl para uma cubeta de eletroporação de 4 mm, colocar no gelo durante 3-5 min. Células eletroporadas utilizando o programa exponencial no sistema de eletroporação com os seguintes parâmetros: 250 V, 500 μF, resistência ∞ e tamanho da cubeta de 4 mm. Após a eletroporação, coloque a cubeta de volta no gelo por 3 min.
nota: Observe a constante de tempo da eletroporação no sistema de eletroporação. A constante de tempo varia com o número de células e a pureza do DNA. As transfecções bem-sucedidas geralmente têm uma constante de tempo entre 10-14 ms ao usar as condições listadas e um pulsador de gene II. Eficiências de eletroporação mais baixas podem ocorrer quando as constantes de tempo variam desses valores.
- Ressuspenda as células eletroporadas em 18 ml de hESC quente suplementado com 10 μM de Y-27632. Coloque 3 ml desta suspensão de célula única em cada poço de uma placa de 6 poços com células alimentadoras DR4. Retorno à incubadora (37 °C/5% CO2/3% O2).
3. Seleção de colônias positivas
- Dia 2, remova todos os meios usando uma pipeta de vidro e aspire. Substitua por 3 ml de meio hESC quente suplementado com 10 μM de Y-27632. Dia 3, remova todos os meios usando uma pipeta de vidro e aspire. Substitua por 3 ml de meio hESC quente sem incluir Y-27632. Dia 4, remova todos os meios usando uma pipeta de vidro e aspire. Substitua por 3 ml de meio hESC quente suplementado com antibióticos para seleção. Retorno à incubadora (37 °C/5% CO2/3% O2).
nota: O tipo de antibiótico usado dependerá do de resistência incluído no modelo de reparo. Ao trabalhar com WIBR#3 hPSCs (registro NIH 0079), 0,5 μg/ml de puromicina, 70 μg/ml de G418 (geneticina) e 35 μg/ml de higromicina foram usados com sucesso. As concentrações para seleção devem ser determinadas empiricamente, estabelecendo a concentração mínima de antibiótico necessária para matar as células do tipo selvagem em aproximadamente uma semana.
- Dias 5-12, troque a mídia diariamente, substituindo a mídia antiga a cada vez por mídia hESC quente suplementada com antibióticos.
nota: Espere uma grande quantidade de morte celular. As colônias individuais se tornarão aparentes por volta do dia 8-10. Meios hESC regulares sem antibióticos podem ser usados após 12-14 dias de seleção contínua. Se a densidade celular for alta ou a morte celular for lenta, a acidificação do meio deve ser evitada e pode ser necessário aumentar o volume do meio (até 4-5 ml) durante os primeiros dias de seleção.
