Edição do genoma baseada em nuclease de dedo de zinco: uma técnica para modificar o genoma em células-tronco pluripotentes humanas por mecanismo de reparo dependente de homologia de fita dupla

Resumo

Fonte: Blair, J. D., et al. Estabelecimento de linhagens de células-tronco pluripotentes humanas editadas pelo genoma: do direcionamento ao isolamento. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra uma técnica de edição de genoma baseada em nuclease de dedo de zinco em células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Como as hPSCs podem ser potencialmente diferenciadas em vários tipos de células, essa tecnologia é útil para estudos patológicos e farmacológicos in vitro de maneira específica do paciente.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Prepare células-tronco para edição

1. Cultive e cultive células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em uma placa de 6 poços contendo 2,4 × 10⁶ células/placa de alimentadores de fibroblastos embrionários de camundongo (MEF) inativados com mitomicina C cultivados em gelatina. Manter hPSCs em 3 ml de meio de células-tronco embrionárias humanas por poço (meio hESC) e crescer em uma incubadora a 37 °C com 3% de O₂/5% CO₂

Resultados

Figura 1. Esquema do locus AAVS1 editado por gene usando o modelo de reparo AAV-CAGGS-EGFP. Modificado de Hockemeyer et al., 2009.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM/F12	Tecnologias da Vida	11320082
Soro fetal bovino (HI)	Tecnologias da Vida	10082-147
Soro Nocaute	Tecnologias da Vida	Rolamento 10828-028
Fator de crescimento de fibroblastos - básico	Tecnologias da Vida	PHG0261
Caneta / estreptococos	Tecnologias da Vida	15140-122
glutamina	Tecnologias da Vida	Rolamento 25030-081
ME NEAA	Tecnologias da Vida	Rolamento 11140-050
2-mercaptoetanol	Tecnologias da Vida	Rolamento 21985-023
Y-27632	Calbioquímica	Nº 688000
Placas de 6 poços	Corning	3506
Cubetas de eletroporação de 4 mm	Bio-rad	165-2081
Pulsador de genes X-cel II	Bio-rad	165-2661
0,25% de tripsina-EDTA	Tecnologias da Vida	Rolamento 25200-056
10× Solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH7.4	Tecnologias da Vida	Rolamento 70011-044
Puromicina	Tecnologias da Vida	A11138-02