Integração de genes direcionados mediada por TALEN: usando nucleases específicas de sequência projetadas para a inserção precisa do gene da proteína fluorescente em hiPSCs

Abstract

Fonte: Cerbini, T. et al. Transfecção, seleção e seleção de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos direcionadas a TALEN com um gene GFP no porto seguro AAVS1. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo descreve uma técnica precisa de edição de genoma em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, ou hiPSCs, usando TALENs para criar quebras de fita dupla em um locus direcionado, induzindo reparo direcionado por homologia para integração de genes de proteínas de fluorescência.

Protocol

1. Preparação da Matriz da Membrana do Basement e Revestimento de Plásticos

1. Coloque o estoque congelado da matriz da membrana basal de -20 ° C no gelo e descongele durante a noite a 4 ° C.
2. Após o descongelamento, pipetar alíquotas de 2 mg da matriz da membrana basal em tubos eppendorf pré-resfriados. Armazene-os a -20 °C até que sejam necessários.
3. Para preparar placas revestidas com matriz de membrana basal, descongele uma alíquota no gelo até que o último pedaço de gelo no tubo eppendorf desapareça (geralmente dentro de ~ 2 horas).
4. Após o descongelamento, adicione a matriz da membrana basal a 12 ml de DMEM/F1....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matriz de Membrana Basal Matrigel com Fator de Crescimento Reduzido (TFG), *Sem LDEV, 10 ml	Corning	Rolamento 354230	Conservar a -20 °C.
DMEM/F-12	Tecnologias da Vida	11320-033	Conservar a 4 °C.
Placas de poços múltiplos tratadas com TC transparente de 6 poços Costar	Corning	3506
Essencial 8 Médio	Tecnologias da Vida	A1517001	Conservar o meio basal a 4 °C. Conservar o suplemento a -20 °C.
Cloridrato de Y-27632	Tocris	1254	Armazene em temperatura ambiente. Uma vez dissolvido em H2O, conservar a -20 °C.
cloreto de sódio	sigma	S5886-500G
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Tecnologias da Vida	Rolamento 15575-020
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Tecnologias da Vida	14190-250
Placa de cultura tratada com TC de 100 mm	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Acadêmico	GlobalStem	GSC-6204G	Armazenar em nitrogênio líquido.
DMEM, glicose alta, piruvato	Tecnologias da Vida	11995-040	Conservar a 4 °C.
Soro Fetal Bovino Definido, Origem dos EUA	HyClone	SH30070.03	Conservar a -20 °C. Descongelar a 4 °C durante a noite e alíquota. Conservar as alíquotas a -20 °C até serem necessárias.
Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM (100X)	Tecnologias da Vida	Rolamento 11140-050	Conservar a 4 °C.
Unidade do núcleo 4D-Nucleofector	Lonza	AAF-1001B	Parte do sistema de eletroporação.
Unidade 4D-Nucleofector X	Lonza	AAF-1001X	Parte do sistema de eletroporação.
P3 Célula Primária 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Ao chegar, remova a solução de células primárias e suplemente e armazene a 4 ° C.
Reagente de dissociação celular StemPro Accutase	Tecnologias da Vida	A1110501	Conservar a -20 °C. Descongelar durante a noite a 4 °C e aquecer uma alíquota em banho-maria a 37 °C antes de utilizar.
Meio de cultura NutriStem XF/FF	Stemgent	01-2005	Conservar a -20 °C. Descongelar durante a noite a 4 °C
TALENs AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 e pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 e 52638
AAVS1-CAG-EGFP Doador de recombinação homóloga	Addgene	Rolamento 22212
Dicloridrato de puromicina	Tecnologias da Vida	A11138-03	Conservar a -20 °C. Preparar alíquotas de trabalho de 1 mg/ml em ddH2O.
Pipetas descartáveis de vidro borossilicato Pasteur	Fisher Científico	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (refrigerado), 120 V 60 Hz	Thermo Científico	Telefone: 75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Rotor de balde oscilante	Thermo Científico	75003607
Solução de Azul de Tripano, 0,4%	Tecnologias da Vida	Rolamento 15250-061