1. Preparação da Matriz da Membrana do Basement e Revestimento de Plásticos
- Coloque o estoque congelado da matriz da membrana basal de -20 ° C no gelo e descongele durante a noite a 4 ° C.
- Após o descongelamento, pipetar alíquotas de 2 mg da matriz da membrana basal em tubos eppendorf pré-resfriados. Armazene-os a -20 °C até que sejam necessários.
- Para preparar placas revestidas com matriz de membrana basal, descongele uma alíquota no gelo até que o último pedaço de gelo no tubo eppendorf desapareça (geralmente dentro de ~ 2 horas).
- Após o descongelamento, adicione a matriz da membrana basal a 12 ml de DMEM/F12 frio (4 °C) para fazer a solução de revestimento da matriz da membrana basal.
- Adicione a solução de matriz de membrana basal ao recipiente de cultura apropriado. Para uma placa de 6 poços, dispense 1 ml por poço. Gire a placa para certificar-se de que a solução de matriz da membrana basal cubra completamente cada poço.
- O parafilme sela a placa/prato revestido com matriz da membrana basal e incube em temperatura ambiente por 1 hora antes do uso. Como alternativa, armazene placas/pratos revestidos com matriz de membrana basal a 4 °C e use dentro de 2 semanas após o revestimento.
nota: Adicione DMEM/F12 extra à placa/prato revestido com matriz da membrana basal para evitar o ressecamento. Antes de usar a placa/prato revestido com matriz de membrana basal armazenada a 4 °C, coloque-a em uma cabine de segurança biológica e deixe-a atingir a temperatura ambiente por pelo menos 30 min.
- Aspire a matriz da membrana basal completamente antes da adição de meio e células.
2. Preparação do meio E8
- Prepare o meio de cultura E8 descongelando o suplemento E8 durante a noite a 4 °C.
- Retirar 10 ml de meio basal E8 do caldo de 500 ml e deitar fora.
- Pipete todo o frasco para injetáveis de 10 ml de suplemento E8 diretamente para 490 ml de meio basal E8. Não aqueça o meio E8 completo em banho-maria a 37 °C, pois flutuações repetidas de temperatura podem degradar o bFGF no meio E8 completo.
- Use o meio E8 completo dentro de 2 semanas após a adição do suplemento.
3. Descongelamento de iPSCs
- Remova um frasco de iPSCs congelados do nitrogênio líquido e coloque em gelo seco.
- Descongelar rapidamente o frasco para injetáveis num banho-maria a 37 °C; agitar o frasco para injetáveis no banho-maria até restar apenas um pequeno fragmento de gelo.
- Pulverize o frasco com etanol a 70% e transfira para uma cabine de segurança biológica.
- Adicione 1 ml de E8 médio à temperatura ambiente gota a gota diretamente no frasco para injetáveis.
- Utilizando uma pipeta de 2 ml, transferir a suspensão celular gota a gota para 9 ml de meio E8 num tubo cónico de 15 ml. Agite o tubo com frequência para garantir que as células e o meio se misturem bem rapidamente.
- Centrifugue as células a 200 x g por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular num volume adequado de E8 suplementado com 10 μM de Y-27632.
- Adicione as células a um número apropriado de poços revestidos com matriz de membrana basal e coloque em uma incubadora de CO₂ a 37 °C e 5% durante a noite. Recomenda-se plaquear pelo menos 0,2 x 10⁶ iPSC por poço de uma placa de 6 poços para permitir uma recuperação rápida após o descongelamento.
4. Manutenção e Passagem de Rotina de iPSCs
- Atualize o E8 médio diariamente.
- Monitore a morfologia e a confluência das células com um microscópio invertido. As iPSCs de alta qualidade crescem em colônias planas com bordas distintas; colônias individuais possuem uma aparência "semelhante a paralelepípedos".
- Passe as células iPSCs quando atingirem ~ 70% de confluência.
- Preparar uma solução de passagem de EDTA adicionando 0,9 g de NaCl e 500 μl de EDTA 0,5 M a 500 ml de DPBS. Misture bem para dissolver o NaCl e aspire o filtro para esterilizar. Aquecer uma alíquota da solução de passagem num banho-maria a 37 °C antes da passagem.
- Para passar, aspire o meio de cultura gasto e lave as células uma vez com um volume igual de solução de passagem quente. Aspire e pipete solução de passagem de EDTA suficiente para revestir as células (1 ml por poço de uma placa de 6 poços).
- Coloque as células sob um microscópio invertido e observe as colônias de iPSC. O aparecimento de buracos dentro das colônias e bordas elevadas deve se tornar aparente dentro de 2 a 5 minutos.
- Aspire cuidadosamente a solução de passagem EDTA.
- Usando uma pipeta de 10 ml, dispense 4 ml de meio E8 (se estiver usando uma placa de 6 poços) sob alta pressão diretamente em cada poço a ser passado.
- Colete os aglomerados de iPSC e divida em um número apropriado de poços, dependendo da proporção de divisão de 1:8 a 1:12. Não pipete demais, pois a desagregação dos aglomerados celulares resultará em baixa viabilidade.
- Coloque a placa em uma incubadora e balance a placa para frente e para trás e de um lado para o outro várias vezes para dispersar as células.
5. Preparação de MEFs e iPSCs para transfecção
- 48 horas antes da transfecção, passe os iPSCs a ~ 1: 6 em quatro ou mais poços de uma placa de 6 poços revestida com matriz de membrana basal, de modo que sejam 70% confluentes daqui a dois dias.
- No dia seguinte, descongele os MEFs DR4 em meio MEF consistindo de DMEM (glicose alta) suplementado com 10% de FBS e 1x MEM-NEAA.
- Coloque os MEFs DR4 em dois pratos de 10 cm a ~ 2 x 10⁴ células/cm² e incube durante a noite a 37 °C.
- No dia da transfecção, troque o meio MEF para E8 suplementado com 10 μM Y-27632 30 min antes de realizar a transfecção em iPSCs.
- Opcional: 4 horas antes da transfecção, suplemente a cultura iPSC pré-transfecção com Y-27632 na concentração final de 10 μM.
6. Tratamento de reagentes de dissociação de células suaves e transfecção de iPSCs usando um sistema de eletroporação
- Remova a solução de transfecção de células primárias P3 de 4 ° C e deixe-a atingir a temperatura ambiente por ~ 30 min. Adicione todo o suplemento de 100 μl à solução de transfecção antes de usar.
- Reagente de dissociação de células suaves quentes em banho-maria a 37 °C.
- Obter TALENs AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 e pZT-AAVS1-R1) e doador AAVS1-CAG-EGFP a partir de -20 °C.
- Remova os iPSCs da incubadora e lave uma vez com DPBS.
- Adicionar 1 ml de reagente de dissociação de células suaves por alvéolo e incubar iPSCs a 37 °C durante 5 minutos ou até que mais de 50% das células se tenham dissociado do recipiente de cultura.
- Pipete as células para cima e para baixo algumas vezes usando uma pipeta p1000 para dissociar quaisquer células restantes do vaso de cultura e quebrar os aglomerados de iPSC.
- Adicione 2 ml de meio E8 a cada poço e pipete para cima e para baixo várias vezes usando uma pipeta de 10 ml para desagregar ainda mais os aglomerados de células em células únicas.
nota: A eficiência da transfecção diminui significativamente se os aglomerados de células não forem suficientemente desagregados.
- Colete iPSCs em um tubo cônico de 15 ml e centrifugue a 100 x g por 3 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em uma quantidade mínima de meio E8.
- Conte as células usando um hemocitômetro após a aplicação de uma coloração vital, como azul de tripano a 0,4%. Certifique-se de que as células estejam suficientemente dissociadas durante a contagem (1-3 células por "aglomerado").
- Dispense 3 x 10⁶ células em cada um dos dois tubos cônicos de 15 ml e gire novamente a 100 x g por 3 min.
nota: A centrifugação de baixa velocidade reduz o estresse da célula e permite fácil ressuspensão de iPSCs antes da eletroporação.
- Defina o sistema de eletroporação para o programa específico do tipo de célula para a linhagem de células-tronco embrionárias humanas H9 (Programa CB-150).
- Após centrifugação, aspirar o sobrenadante dos sedimentos celulares. A um pellet, adicionar 10 μg do dador HR como amostra de controlo. Ao outro pellet, adicionar 10 μg do doador de HR, juntamente com 5 μg de cada TALEN (pZT-AAVS1-L1 e pZT-AAVS1-R1) como amostra experimental.
- Ressuspenda cada pellet celular em 100 μl de solução de transfecção de células primárias P3 e transfira para uma cubeta.
- Realize a transfecção e adicione imediatamente 500 μl de meio E8 à temperatura ambiente a cada cubeta.
- Transferir as iPSCs transfectadas gota a gota para uma cápsula de 10 cm contendo MEFs DR4 preparados no passo 5.4.
