Integração de genes direcionados mediada por TALEN: usando nucleases específicas de sequência projetadas para a inserção precisa do gene da proteína fluorescente em hiPSCs

Abstract

Fonte: Cerbini, T. et al. Transfecção, seleção e seleção de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos direcionadas a TALEN com um gene GFP no porto seguro AAVS1. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo descreve uma técnica precisa de edição de genoma em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, ou hiPSCs, usando TALENs para criar quebras de fita dupla em um locus direcionado, induzindo reparo direcionado por homologia para integração de genes de proteínas de fluorescência.

Protocol

1. Preparação da Matriz da Membrana do Basement e Revestimento de Plásticos

1. Coloque o estoque congelado da matriz da membrana basal de -20 ° C no gelo e descongele durante a noite a 4 ° C.
2. Após o descongelamento, pipetar alíquotas de 2 mg da matriz da membrana basal em tubos eppendorf pré-resfriados. Armazene-os a -20 °C até que sejam necessários.
3. Para preparar placas revestidas com matriz de membrana basal, descongele uma alíquota no gelo até que o último pedaço de gelo no tubo eppendorf desapareça (geralmente dentro de ~ 2 horas).
4. Após o descongelamento, adicione a matriz da membrana basal a 12 ml de DMEM/F12 frio (4 °C) para fazer a solução de revestimento da matriz da membrana basal.
5. Adicione a solução de matriz de membrana basal ao recipiente de cultura apropriado. Para uma placa de 6 poços, dispense 1 ml por poço. Gire a placa para certificar-se de que a solução de matriz da membrana basal cubra completamente cada poço.
6. O parafilme sela a placa/prato revestido com matriz da membrana basal e incube em temperatura ambiente por 1 hora antes do uso. Como alternativa, armazene placas/pratos revestidos com matriz de membrana basal a 4 °C e use dentro de 2 semanas após o revestimento.
   nota: Adicione DMEM/F12 extra à placa/prato revestido com matriz da membrana basal para evitar o ressecamento. Antes de usar a placa/prato revestido com matriz de membrana basal armazenada a 4 °C, coloque-a em uma cabine de segurança biológica e deixe-a atingir a temperatura ambiente por pelo menos 30 min.
7. Aspire a matriz da membrana basal completamente antes da adição de meio e células.

2. Preparação do meio E8

1. Prepare o meio de cultura E8 descongelando o suplemento E8 durante a noite a 4 °C.
2. Retirar 10 ml de meio basal E8 do caldo de 500 ml e deitar fora.
3. Pipete todo o frasco para injetáveis de 10 ml de suplemento E8 diretamente para 490 ml de meio basal E8. Não aqueça o meio E8 completo em banho-maria a 37 °C, pois flutuações repetidas de temperatura podem degradar o bFGF no meio E8 completo.
4. Use o meio E8 completo dentro de 2 semanas após a adição do suplemento.

3. Descongelamento de iPSCs

1. Remova um frasco de iPSCs congelados do nitrogênio líquido e coloque em gelo seco.
2. Descongelar rapidamente o frasco para injetáveis num banho-maria a 37 °C; agitar o frasco para injetáveis no banho-maria até restar apenas um pequeno fragmento de gelo.
3. Pulverize o frasco com etanol a 70% e transfira para uma cabine de segurança biológica.
4. Adicione 1 ml de E8 médio à temperatura ambiente gota a gota diretamente no frasco para injetáveis.
5. Utilizando uma pipeta de 2 ml, transferir a suspensão celular gota a gota para 9 ml de meio E8 num tubo cónico de 15 ml. Agite o tubo com frequência para garantir que as células e o meio se misturem bem rapidamente.
6. Centrifugue as células a 200 x g por 5 min.
7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular num volume adequado de E8 suplementado com 10 μM de Y-27632.
8. Adicione as células a um número apropriado de poços revestidos com matriz de membrana basal e coloque em uma incubadora de CO₂ a 37 °C e 5% durante a noite. Recomenda-se plaquear pelo menos 0,2 x 10⁶ iPSC por poço de uma placa de 6 poços para permitir uma recuperação rápida após o descongelamento.

4. Manutenção e Passagem de Rotina de iPSCs

1. Atualize o E8 médio diariamente.
2. Monitore a morfologia e a confluência das células com um microscópio invertido. As iPSCs de alta qualidade crescem em colônias planas com bordas distintas; colônias individuais possuem uma aparência "semelhante a paralelepípedos".
3. Passe as células iPSCs quando atingirem ~ 70% de confluência.
4. Preparar uma solução de passagem de EDTA adicionando 0,9 g de NaCl e 500 μl de EDTA 0,5 M a 500 ml de DPBS. Misture bem para dissolver o NaCl e aspire o filtro para esterilizar. Aquecer uma alíquota da solução de passagem num banho-maria a 37 °C antes da passagem.
5. Para passar, aspire o meio de cultura gasto e lave as células uma vez com um volume igual de solução de passagem quente. Aspire e pipete solução de passagem de EDTA suficiente para revestir as células (1 ml por poço de uma placa de 6 poços).
6. Coloque as células sob um microscópio invertido e observe as colônias de iPSC. O aparecimento de buracos dentro das colônias e bordas elevadas deve se tornar aparente dentro de 2 a 5 minutos.
7. Aspire cuidadosamente a solução de passagem EDTA.
8. Usando uma pipeta de 10 ml, dispense 4 ml de meio E8 (se estiver usando uma placa de 6 poços) sob alta pressão diretamente em cada poço a ser passado.
9. Colete os aglomerados de iPSC e divida em um número apropriado de poços, dependendo da proporção de divisão de 1:8 a 1:12. Não pipete demais, pois a desagregação dos aglomerados celulares resultará em baixa viabilidade.
10. Coloque a placa em uma incubadora e balance a placa para frente e para trás e de um lado para o outro várias vezes para dispersar as células.

5. Preparação de MEFs e iPSCs para transfecção

1. 48 horas antes da transfecção, passe os iPSCs a ~ 1: 6 em quatro ou mais poços de uma placa de 6 poços revestida com matriz de membrana basal, de modo que sejam 70% confluentes daqui a dois dias.
2. No dia seguinte, descongele os MEFs DR4 em meio MEF consistindo de DMEM (glicose alta) suplementado com 10% de FBS e 1x MEM-NEAA.
3. Coloque os MEFs DR4 em dois pratos de 10 cm a ~ 2 x 10⁴ células/cm² e incube durante a noite a 37 °C.
4. No dia da transfecção, troque o meio MEF para E8 suplementado com 10 μM Y-27632 30 min antes de realizar a transfecção em iPSCs.
5. Opcional: 4 horas antes da transfecção, suplemente a cultura iPSC pré-transfecção com Y-27632 na concentração final de 10 μM.

6. Tratamento de reagentes de dissociação de células suaves e transfecção de iPSCs usando um sistema de eletroporação

1. Remova a solução de transfecção de células primárias P3 de 4 ° C e deixe-a atingir a temperatura ambiente por ~ 30 min. Adicione todo o suplemento de 100 μl à solução de transfecção antes de usar.
2. Reagente de dissociação de células suaves quentes em banho-maria a 37 °C.
3. Obter TALENs AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 e pZT-AAVS1-R1) e doador AAVS1-CAG-EGFP a partir de -20 °C.
4. Remova os iPSCs da incubadora e lave uma vez com DPBS.
5. Adicionar 1 ml de reagente de dissociação de células suaves por alvéolo e incubar iPSCs a 37 °C durante 5 minutos ou até que mais de 50% das células se tenham dissociado do recipiente de cultura.
6. Pipete as células para cima e para baixo algumas vezes usando uma pipeta p1000 para dissociar quaisquer células restantes do vaso de cultura e quebrar os aglomerados de iPSC.
7. Adicione 2 ml de meio E8 a cada poço e pipete para cima e para baixo várias vezes usando uma pipeta de 10 ml para desagregar ainda mais os aglomerados de células em células únicas.
   nota: A eficiência da transfecção diminui significativamente se os aglomerados de células não forem suficientemente desagregados.
8. Colete iPSCs em um tubo cônico de 15 ml e centrifugue a 100 x g por 3 min.
9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em uma quantidade mínima de meio E8.
10. Conte as células usando um hemocitômetro após a aplicação de uma coloração vital, como azul de tripano a 0,4%. Certifique-se de que as células estejam suficientemente dissociadas durante a contagem (1-3 células por "aglomerado").
11. Dispense 3 x 10⁶ células em cada um dos dois tubos cônicos de 15 ml e gire novamente a 100 x g por 3 min.
    nota: A centrifugação de baixa velocidade reduz o estresse da célula e permite fácil ressuspensão de iPSCs antes da eletroporação.
12. Defina o sistema de eletroporação para o programa específico do tipo de célula para a linhagem de células-tronco embrionárias humanas H9 (Programa CB-150).
13. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante dos sedimentos celulares. A um pellet, adicionar 10 μg do dador HR como amostra de controlo. Ao outro pellet, adicionar 10 μg do doador de HR, juntamente com 5 μg de cada TALEN (pZT-AAVS1-L1 e pZT-AAVS1-R1) como amostra experimental.
14. Ressuspenda cada pellet celular em 100 μl de solução de transfecção de células primárias P3 e transfira para uma cubeta.
15. Realize a transfecção e adicione imediatamente 500 μl de meio E8 à temperatura ambiente a cada cubeta.
16. Transferir as iPSCs transfectadas gota a gota para uma cápsula de 10 cm contendo MEFs DR4 preparados no passo 5.4.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matriz de Membrana Basal Matrigel com Fator de Crescimento Reduzido (TFG), *Sem LDEV, 10 ml	Corning	Rolamento 354230	Conservar a -20 °C.
DMEM/F-12	Tecnologias da Vida	11320-033	Conservar a 4 °C.
Placas de poços múltiplos tratadas com TC transparente de 6 poços Costar	Corning	3506
Essencial 8 Médio	Tecnologias da Vida	A1517001	Conservar o meio basal a 4 °C. Conservar o suplemento a -20 °C.
Cloridrato de Y-27632	Tocris	1254	Armazene em temperatura ambiente. Uma vez dissolvido em H2O, conservar a -20 °C.
cloreto de sódio	sigma	S5886-500G
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Tecnologias da Vida	Rolamento 15575-020
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Tecnologias da Vida	14190-250
Placa de cultura tratada com TC de 100 mm	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Acadêmico	GlobalStem	GSC-6204G	Armazenar em nitrogênio líquido.
DMEM, glicose alta, piruvato	Tecnologias da Vida	11995-040	Conservar a 4 °C.
Soro Fetal Bovino Definido, Origem dos EUA	HyClone	SH30070.03	Conservar a -20 °C. Descongelar a 4 °C durante a noite e alíquota. Conservar as alíquotas a -20 °C até serem necessárias.
Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM (100X)	Tecnologias da Vida	Rolamento 11140-050	Conservar a 4 °C.
Unidade do núcleo 4D-Nucleofector	Lonza	AAF-1001B	Parte do sistema de eletroporação.
Unidade 4D-Nucleofector X	Lonza	AAF-1001X	Parte do sistema de eletroporação.
P3 Célula Primária 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Ao chegar, remova a solução de células primárias e suplemente e armazene a 4 ° C.
Reagente de dissociação celular StemPro Accutase	Tecnologias da Vida	A1110501	Conservar a -20 °C. Descongelar durante a noite a 4 °C e aquecer uma alíquota em banho-maria a 37 °C antes de utilizar.
Meio de cultura NutriStem XF/FF	Stemgent	01-2005	Conservar a -20 °C. Descongelar durante a noite a 4 °C
TALENs AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 e pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 e 52638
AAVS1-CAG-EGFP Doador de recombinação homóloga	Addgene	Rolamento 22212
Dicloridrato de puromicina	Tecnologias da Vida	A11138-03	Conservar a -20 °C. Preparar alíquotas de trabalho de 1 mg/ml em ddH2O.
Pipetas descartáveis de vidro borossilicato Pasteur	Fisher Científico	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (refrigerado), 120 V 60 Hz	Thermo Científico	Telefone: 75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Rotor de balde oscilante	Thermo Científico	75003607
Solução de Azul de Tripano, 0,4%	Tecnologias da Vida	Rolamento 15250-061