phiC31-Integração de transgene dirigida ao local mediada por integrase: uma técnica de microinjeção para integração de transgene específico do local em um vetor de Anopheles

1. Preparação de plasmídeos para a mistura de microinjecção

NOTA: O protocolo ilustrado aqui envolve o uso de dois plasmídeos: um plasmídeo doador marcado com attB (local de fixação derivado da bactéria hospedeira) carregando o transgene de interesse e um plasmídeo auxiliar que expressa a integrase φC31 sob a regulação do promotor Drosophila Hsp70.

1. Purifique os plasmídeos doadores e auxiliares usando um kit de purificação de plasmídeos livres de endotoxinas.
   nota: Sequencie a preparação final do plasmídeo usada para injeção para verificar a integridade de todos os componentes.
2. Combinar quantidades adequadas dos dois plasmídeos para obter uma mistura com uma concentração final de 350 ng/μl do plasmídeo dador e de 150 ng/μl do plasmídeo auxiliar quando ressuspensos em tampão de injecção.
   nota: Ao calcular o volume necessário de mistura, considere que 10-15 μL são suficientes para cada dia de injeções planejadas e o DNA pode ser preparado com antecedência e armazenado a -20 °C. Concentrações de plasmídeo auxiliar de integrase de 60-500 ng/μL e concentrações de plasmídeo de doador de 85-200 ng/μL também foram relatadas.
3. Precipite o DNA adicionando 0,1 volumes de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 2,5 volumes de EtOH 100% gelado e vórtice. Um precipitado branco deve ser imediatamente visível. Ter preparações de plasmídeo iniciais altamente concentradas (ou seja, ~ 1 μg / μL) melhora a eficiência da precipitação.
   nota: Ponto de parada - O precipitado pode ser armazenado a -20 °C durante a noite.
4. Centrifugue a 15.000 x g por 20 min a 4 ° C, descarte o sobrenadante e lave o pellet com 1 mL de EtOH 70% gelado.
5. Lave o pellet com 1 mL de EtOH 70% gelado e centrifugue a 15.000 x g por 5 min em temperatura ambiente.
6. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o pellet e secar ao ar.
7. Ressuspenda o pellet em 1x tampão de injeção (0,1 mM Na,₃PO₄, 5 mM KCl, pH 7,2, 0,22 μm, filtro esterilizado) para atingir uma concentração final total de 500 ng/μL.
   nota: Suponha que algum DNA seja perdido durante o processo de precipitação; portanto, adicione um volume menor de tampão de injeção primeiro, verifique a concentração em um espectrofotômetro (por exemplo, Nanodrop) e, em seguida, adicione um volume restante apropriado para atingir 500 ng/μL.
8. Assegurar que o ADN é completamente ressuspenso, preparar alíquotas de 10-15 μL cada e armazená-las a -20 °C.
9. No dia da injeção, descongele uma alíquota e centrifugue a 15.000 x g por 5 min para remover quaisquer resíduos de partículas.
   NOTA: Um método alternativo para remoção de partículas é filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm. Evite a presença de resíduos de partículas na mistura de injeção, pois eles levam ao bloqueio da agulha durante a microinjeção de embriões.

2. Microinjeção de embriões de uma linha de ancoragem de Anopheles

1. Alimente com sangue mosquitos de 4 a 7 dias da linha de ancoragem desejada 72 horas antes da microinjeção (ou seja, para injeção na segunda e terça-feira, alimente as fêmeas na sexta-feira anterior; para injeção na quinta e sexta-feira, alimente as fêmeas na segunda-feira da mesma semana).
2. Sangue alimenta mosquitos do tipo selvagem (WT) (ou seja, mosquitos com o mesmo fundo genômico da linha de acoplamento) no mesmo dia; estes serão necessários para o cruzamento.
   nota: O tamanho e a qualidade da refeição de sangue afetam a qualidade do óvulo, por isso é recomendável sempre usar sangue fresco (ou seja, sangue coletado nos últimos 7 dias). A alimentação com braços ou camundongos pode aumentar a qualidade e a quantidade de ovos, no entanto, esses métodos não são incentivados. Protocolos específicos aprovados serão necessários para uso humano e animal.
3. Realizar microinjeções de embriões
   1. Realize microinjeções de embriões de An. gambiae em NaCl 25 mM, visando o pólo posterior do embrião em um ângulo de 45 graus. Para um protocolo detalhado para coleta, alinhamento e microinjeção de embriões, consulte Pondeville et al.e Lobo et al.
   2. Realize microinjeções de embriões de An. stephensi em óleo de halocarbono 700:27 (2:1) visando o pólo posterior do embrião em um ângulo de 30 graus. Um protocolo detalhado para coleta, alinhamento e microinjeção de embriões pode ser encontrado em Terenius et al.e Lobo et al.
   3. Transferir os ovos imediatamente após a injecção para uma placa de Petri cheia de água destilada estéril (pH 7,2) e voltar a colocá-los em condições de insectário.
4. Após a eclosão, transfira as larvas G₀ para uma bandeja com água destilada com sal (0,1% de sal tônico) diariamente e crie para as pupas.
5. Taxa de eclosão recorde (ou seja, número de larvas eclodidas / número de embriões injetados).
   nota: O movimento do embrião ajuda na eclosão, portanto, um giro suave é desejável. A eclosão deve começar ~ 48 h após a injeção. Como a injeção pode causar um leve atraso no desenvolvimento, é aconselhável manter o monitoramento de larvas de eclosão tardia por 3-4 dias.