$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Definição do protoespaçador e construção do plasmídeo
NOTA: Nesta seção, é descrito o primeiro passo de seleção de protoespaçadores apropriados para construir o sgRNA e posterior ligação em pMaOri.dCas9 (Figura 1). Esta sequência protoespaçadora é composta por uma sequência de 20 nucleotídeos contra o alvo desejado.
- Obtenha a sequência de nucleotídeos do gene de interesse para silenciamento no GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Submeta-o ao servidor web CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), com parâmetros definidos para Streptococcus pyogenes Cas9 e motivo adjacente ao protoespaçador NGG após selecionar o "Fasta Target". Defina os parâmetros para "CRISPR/Cas9" e PAM (motivo adjacente do protoespaçador) NGG.
- Com base nos resultados obtidos, selecione protoespaçadores com a melhor pontuação possível (seta verde), que estejam localizados o mais próximo possível da extremidade 5' da região codificante e, o mais importante, estejam contidos na fita molde (menos), uma vez que o sgRNA deve emparelhar com a fita codificante do gene para silenciamento completo do gene.
nota: O motivo NGG não está incluído na sequência final do sgRNA.
- Use o promotor lipL32 para expressar o RNA guia único que contém uma sequência variável de 20 nucleotídeos na extremidade 5 'e uma sequência de andaime dCas9 conservada. Mescle a sequência de 20 nt, denominada protoespaçador, ao promotor lipL32 (em sua extremidade 5 ') e ao andaime sgRNA (extremidade 3') (Figura 1B).
nota: Para um promotor lipL32 bem definido, utilize a região promotora compreendendo -334 para o TSS (Transcription Start Site, baseado em Zhukova et al.). Verifique a Tabela 1 para o final de sgRNA.
- Gere o de sgRNA por PCR sequencial ou sintetize-o por um provedor comercial.
- Depois de obter o, ligue-o ao plasmídeo pMaOri.dCas9 no local de restrição XmaI em ambas as extremidades (cccggg).
- Digerir o de sgRNA e o plasmídeo pMaOri.dCas9 com a enzima de restrição XmaI e proceder à ligação (Figura 1B).
- Execute as etapas de clonagem na cepa π1 de E. coli auxotrófica dT, devido à origem da replicação pMaOri (e, por extensão, pMaOri.dCas9), R6K-gamma.
NOTA: Para um protocolo detalhado de ligadura e seleção de clones, consulte as publicações anteriores de Fernandes e Nascimento. O dCas9 guiado por sgRNA se ligará à fita codificante do gene selecionado de interesse e, portanto, obstruirá o alongamento da RNA polimerase ( Figura 1C ), resultando em silenciamento do gene.
2. Transformação de Leptospira por conjugação
NOTA: Um esquema gráfico desta etapa é apresentado na Figura 2. Para fazer meios HAN e placas HAN, consulte Hornsby et al. e Fernandes et al.
- Cultivar células patogênicas de Leptospira a 29 ou 37 °C em meio HAN sob agitação, diluindo uma cultura saturada em HAN fresco a 1:100; tipicamente, L. interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 leva de 4 a 6 dias para atingir a densidade celular apropriada.
- Certifique-se de que as culturas atinjam um diâmetro externo de 0,2-0,4 a 420 nm (2 a 5 x 10,8 células/mL) antes de usar para conjugação.
nota: Como o meio HAN muda de cor à medida que as densidades celulares aumentam (devido ao vermelho de fenol contido no meio DMEM), centrifugue (4.000 x g, 15 min, temperatura ambiente) 1 mL do meio de cultura para remover leptospiras e aplique sobrenadante como um branco para medir o OD.
- Transformar a cepa conjugativa de E. coli β2163, auxotrófica para ácido diaminopimélico (DAP), com o plasmídeo pMaOri.dCas9 contendo o de sgRNA. Para a transformação de E. coli, use protocolos de choque térmico ou eletroporação. Inclua a transformação com o plasmídeo pMaOri.dCas9 sem de sgRNA como controle.
- Para a transformação por choque térmico, misturar o ADN do plasmídeo (100 ng) com células de E. coli quimicamente competentes e incubar em gelo durante 30 min. Efectuar choque térmico a 42 °C durante 90 s e voltar a colocá-lo em gelo durante 5 min. Recuperar as células adicionando 1 ml de meio LB, incubar a 37 °C durante 1 h e proceder à plaqueagem.
- Para eletroporação, use células eletrocompetentes misturadas com 100 ng de DNA de plasmídeo. Use os seguintes parâmetros para pulso: 1.8 kV, 100 Ω e 25 μF. Recupere as células conforme explicado acima.
- Plaquear as células de E. coli do doador transformadas em meio de ágar LB suplementado com ácido diaminopimélico (DAP) (0,3 mM) e espectinomicina (40 μg/mL) para selecionar plasmídeos.
- Para a conjugação, selecione uma colônia de cada placa um dia antes do dia da conjugação (que é determinado pelo monitoramento do OD das culturas de leptospiras).
- Selecione uma colônia de E. coli β2163 das placas pMaOri.dCas9 vazias e uma das placas pMaOri.dCas9sgRNA. Deixe-os crescer durante a noite em 10 mL de LB mais DAP e espectinomicina a 37 ° C.
- No dia seguinte, diluir as culturas saturadas 1:100 em 10 mL de LB fresco mais DAP (não incluir o antibiótico aqui) até OD420nm de 0,2-0,4. Normalmente, leva de 2 a 3 horas para a E. coli atingir essas densidades.
- Dentro de uma coifa de biossegurança BSL2, monte um aparelho de filtração colocando um filtro de membrana de ésteres de celulose mistos de 25 mm de diâmetro e tamanho de poro de 0,1 μm na parte superior da base de vidro. Coloque um funil de vidro de 15 mL na parte superior e segure ambas as peças com grampos de mola. Conecte o vidro a uma bomba de vácuo e adicione as culturas ao funil para filtração.
- Adicione 5 mL de cultura de Leptospira ao funil. Adicione um volume de E. coli para constituir a proporção de 1:1 com base nos valores de OD420nm de ambas as culturas. Ligue a bomba de vácuo e concentre as células por filtração. Após a concentração da célula no filtro de membrana, recupere-a cuidadosamente. Certifique-se de que o meio seja filtrado através da membrana.
nota: A filtração leva de 5 a 10 min.
- Coloque o filtro em uma placa EMJH disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) complementada com DAP (0.3 mM). Certifique-se de que o lado das bactérias esteja para cima. Incubar as placas a 29 °C durante 24 h.
nota: Se forem usadas placas de HAN ou EMJH suplementadas internamente, a E. coli pode proliferar e superar a proporção pretendida de 1:1, o que, por sua vez, pode diminuir a eficiência da conjugação.
- Após 24 h, recupere os filtros das placas e coloque cada filtro individual em um tubo cônico de 50 mL.
- Use 1 mL de meio HAN líquido para liberar as células da superfície do filtro por pipetagem e vórtice extensivos.
- Visualize as soluções bacterianas mistas recuperadas por microscopia de campo escuro para verificar a viabilidade e motilidade celular e proporções de Leptospira:E. coli.
nota: Nesta fase, números equivalentes de E. coli e Leptospira podem ser vistos.
- Espalhe 100-200 μL desta cultura em placas HAN contendo 0,4% de soro de coelho inativado e 40 μg / mL de espectinomicina. Incubar placas a 37 °C em atmosfera de CO2 a 3%
forte>NOTA: Normalmente, as células L1-130 do sorovar Copenhageni de L. interrogans formam colônias em 5-7 dias em placas controle e em 8-10 dias em placas de espectinomicina. Nesta fase, E. coli não crescerá, pois são auxotróficas para DAP.
- Como controle, diluir culturas a 104 leptospiras/mL e adicionar 100 μL em placas sem antibiótico, para monitorar o crescimento da leptospira.