Expressão gênica baseada em sistema regulável por tet-on induzível in vivo: um sistema de expressão gênica induzido por tetraciclina para ativação da transcrição do gene alvo em modelo de camundongo

Resumo

Fonte: Hübner, E. K. et al.Sistemas Constitutivos e Induzíveis para Modificação Genética In Vivo de Hepatócitos de Camundongos Usando Injeção Hidrodinâmica de Veias da Cauda. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o sistema de expressão gênica da tetraciclina, ou Tet-On, em um modelo de camundongo. Na presença de doxiciclina, um derivado da tetraciclina, o sistema Tet-On que consiste na proteína transativadora reversa controlada por tetraciclina é ativado e expressa o gene de interesse.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Indução da expressão do gene dependente de tetraciclina ou shRNA

CUIDADO: A doxiciclina pode ser prejudicial. Consulte a ficha de dados de segurança.

NOTA: Dependendo do tipo e duração do experimento, a doxiciclina pode ser fornecida na água potável.

1. Para experimentos de curto prazo (<10 dias), administre doxiciclina através da água potável usando o seguinte protocolo.
   1. Dissolva 5 g de sacarose em 100 mL de água da torneira. Autoclave.
   2. Dissolva 100 mg de doxiciclina-hiclato em 5 ml de solução de sacarose (passo 1.1.1) num tubo cónico de 15 ml.
   3. Usando uma seringa de 10 mL, filtre a solução através de um filtro de 0,2 μm. Adicionar à solução de sacarose preparada no passo 1.1.1.
   4. Forneça solução de doxiciclina-sacarose como água potável para o camundongo. Verifique diariamente e substitua quando a solução ficar turva, indicando crescimento excessivo de bactérias (substitua a solução límpida após três dias, o mais tardar).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
D(+)-sacarose	Carl Roth	Rolamento 4621.1	Para adoçar a solução de doxicilina
Hiclato de doxiciclina	Aplicação	A2951,0025	Ativação da expressão dependente de tetraciclina
Seringa Injekt 10 ml	Braun	4606108V
Filtropur S 0.2	Sarstedt	831.826.001	Para filtração de doxiciclina