Silenciamento de genes baseado em transfecção reversa de siRNA in vitro: um procedimento para entregar pequenos RNAs interferentes em células cultivadas para inativar a expressão do gene alvo

Resumo

Fonte: Jager, J. et al.Um modelo de cultura de células de adipócitos para estudar o impacto da modulação de proteínas e micro-RNA na função dos adipócitos. J. Vis. Exp. (2021).

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para realizar a transfecção reversa de siRNA em adipócitos para modular a expressão de uma proteína alvo.

Protocolo

1. Preparação de placas pré-revestidas

1. No dia anterior ou algumas horas antes da transfecção, prepare uma solução de colágeno tipo I a 100 μg/mL em etanol a 30% a partir de uma solução estoque a 1 mg/mL. Adicione 250 μL de colágeno por poço de uma placa de 12 poços e 125 μL por poço de uma placa de 24 poços e espalhe a solução sobre a superfície do poço.
2. Deixe a placa sem a tampa sob a capa de cultura até que o colágeno seque. Lave duas vezes com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS).
   NOTA: Placas pré-revestidas estão disponíveis para compra.

2. Preparação da mistura de transfecção

NOTA: A concentração final de siRNA está entre 1 e 100 nM (1 a 100 pmol de siRNA por poço de uma placa de 12 poços). A concentração final do miR é de 10 nM (10 pmol/poço). Determine a melhor concentração de cada siRNA, miR mimico ou outro oligonucleotídeo antes de iniciar o experimento para evitar efeitos fora do alvo. Realize experimentos de transfecção em triplicata para facilitar a análise estatística dos resultados. Prepare todos os reagentes em excesso para compensar a perda normal durante a pipetagem.

1. Misture por pipetagem (volume / volume) o siRNA (ou outros oligonucleotídeos) com o meio essencial mínimo aprimorado (Tabela 1). Incube por 5 min em temperatura ambiente.
2. Adicione o reagente de transfecção e o meio essencial mínimo aprimorado ao siRNA e pipete para misturar (Tabela 1). Incube por 20 min em temperatura ambiente (durante este tempo, prossiga para a seção 3). Adicione a mistura de transfecção a cada poço da placa revestida de colágeno.

3. Preparação dos adipócitos 3T3-L1

1. Lavar as células da placa de Petri de 100 mm duas vezes com D-PBS. Adicione 5x tripsina às células (1 mL por prato de 100 mm), certificando-se de cobrir toda a superfície com a tripsina. Aguarde 30 s e remova cuidadosamente a tripsina.
2. Incubar a placa de Petri durante 5-10 min a 37 °C na incubadora. Bata no prato de 100 mm para separar as células.
3. Adicione 10 ml de DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, 10% de FCS e 1% de penicilina e estreptomicina para neutralizar a tripsina. Pipete cuidadosamente o meio para cima e para baixo para separar as células e homogeneizar a suspensão celular.
4. Conte as células usando uma câmara de contagem de Malassez ou um contador de células automatizado e ajuste a concentração das células para 6,25 x 10⁵ células / mL de meio. Semear 800 μL da suspensão/poço celular de uma placa de 12 poços (5 x 10⁵ células) ou 400 μl da suspensão/poço celular de uma placa de 24 poços (2,5 x 10⁵ células) contendo a mistura de transfecção.
   nota: Uma placa de Petri de 100 mm de adipócitos permitirá a preparação de uma placa de 12 poços ou uma placa de 24 poços. Uma placa de 100 mm geralmente contém 6-7 x 10⁶ adipócitos, que correspondem a 5 x 10⁵ adipócitos por poço de uma placa de 12 poços.
5. Incubar as placas numa incubadora de cultura de células (7% de CO2 e 37 °C) e não perturbar as células durante 24 h. No dia seguinte, substitua cuidadosamente o sobrenadante por DMEM fresco sem piruvato, glicose 25 mM, FCS 10% e penicilina e estreptomicina 1><%. NOTA: Também é possível semear as células em placas de 48 e 96 poços pré-revestidas com colágeno, mas tome mais precauções ao substituir o meio para evitar o descolamento dos adipócitos.

	Por poço (placa de 12 poços)	Por poço (placa de 24 poços)
Oligonucleotídeos	20 μL	10 μL
(si-RNA, miR...)
Meio essencial mínimo aprimorado	20 μL	10 μL
Reagente de transfecção	5,6 μL	2,8 μL
Meio essencial mínimo aprimorado	154,4 μL	77,2 μL
Volume total da mistura de transfecção	200 μL	100 μL

Tabela 1: Reagentes de transfecção necessários para formatos de placa de 12 e 24 poços.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de tecidos de 12 poços	Dutscher	353043
2,5% de tripsina (10x)	Gibco	15090-046	Diluído a 5x com D-PBS
2-propanol	sigma	I9516
3-Isobutil-1-metilxantina	Sigma-Aldrich	D5879
Albumina de soro bovino (BSA)	sigma	Rolamento A7030
Colágeno tipo I da pele da panturrilha	Sigma-Aldrich	C8919
dexametasona	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Meio de Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco	41965062	4,5 g/L de D-glicose; L-Glutamina; sem piruvato
etanol	sigma	Rolamento 51976
miRIDIAN micro-RNA imita	Descoberta do Horizon
SiRNA de controle negativo marcado com FAM	Invitrogen	AM4620
Soro de bezerro recém-nascido	Gibco	16010-159
Soro fetal bovino	Gibco	10270-106
Penicilina e estreptomicina	Gibco	15140-122
SiRNA de controle negativo marcado com FAM	Invitrogen	AM4620
ON-TARGETplus Mouse Plin1 siRNA SMARTpool	Descoberta do Horizon	L-056623-01-0005
Reagente de glicerol livre	Sigma-Aldrich	Rolamento F6428
Placa de Petri 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
Reagente de transfecção (INTERFERin)	Poliplus	409-10
Meio essencial mínimo aprimorado (Opti-MEM)	Gibco	Rolamento 31985-047
Insulina Recombinante Humana	Gibco	Rolamento 12585-014