Silenciamento de genes baseado em transfecção reversa de siRNA in vitro: um procedimento para entregar pequenos RNAs interferentes em células cultivadas para inativar a expressão do gene alvo

Resumo

Fonte: Jager, J. et al.Um modelo de cultura de células de adipócitos para estudar o impacto da modulação de proteínas e micro-RNA na função dos adipócitos. J. Vis. Exp. (2021).

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para realizar a transfecção reversa de siRNA em adipócitos para modular a expressão de uma proteína alvo.

Protocolo

1. Preparação de placas pré-revestidas

1. No dia anterior ou algumas horas antes da transfecção, prepare uma solução de colágeno tipo I a 100 μg/mL em etanol a 30% a partir de uma solução estoque a 1 mg/mL. Adicione 250 μL de colágeno por poço de uma placa de 12 poços e 125 μL por poço de uma placa de 24 poços e espalhe a solução sobre a superfície do poço.
2. Deixe a placa sem a tampa sob a capa de cultura até que o colágeno seque. Lave duas vezes com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS).
   NOTA: Placas pré-revestidas estão disponíveis para compra.

2. P....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de tecidos de 12 poços	Dutscher	353043
2,5% de tripsina (10x)	Gibco	15090-046	Diluído a 5x com D-PBS
2-propanol	sigma	I9516
3-Isobutil-1-metilxantina	Sigma-Aldrich	D5879
Albumina de soro bovino (BSA)	sigma	Rolamento A7030
Colágeno tipo I da pele da panturrilha	Sigma-Aldrich	C8919
dexametasona	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Meio de Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco	41965062	4,5 g/L de D-glicose; L-Glutamina; sem piruvato
etanol	sigma	Rolamento 51976
miRIDIAN micro-RNA imita	Descoberta do Horizon
SiRNA de controle negativo marcado com FAM	Invitrogen	AM4620
Soro de bezerro recém-nascido	Gibco	16010-159
Soro fetal bovino	Gibco	10270-106
Penicilina e estreptomicina	Gibco	15140-122
SiRNA de controle negativo marcado com FAM	Invitrogen	AM4620
ON-TARGETplus Mouse Plin1 siRNA SMARTpool	Descoberta do Horizon	L-056623-01-0005
Reagente de glicerol livre	Sigma-Aldrich	Rolamento F6428
Placa de Petri 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
Reagente de transfecção (INTERFERin)	Poliplus	409-10
Meio essencial mínimo aprimorado (Opti-MEM)	Gibco	Rolamento 31985-047
Insulina Recombinante Humana	Gibco	Rolamento 12585-014