$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Transfecção do plasmídeo de resposta que expressa o gene de interesse (GOI) em células epiteliais alveolares primárias
- Isole as células epiteliais alveolares do tipo II dos pulmões de ratos.
- Semeie as células a uma densidade de 1 x 106 células/cm, 2 em placas de Petri de 100 mm com meio essencial mínimo completo (MEM completo). O MEM completo é suplementado com 10% de FBS, 0,08 mg/L de tobramicina, Septra (3 μg/mL de trimetoprim e 17 μg/mL de sulfametoxazol), 0,2% de NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) e 2 mM de L-glutamina. Cultivar as células durante 24 h a 37 °C em 5% de CO2 numa incubadora humidificada.
- No dia seguinte, colocar 500 μL de MEM completo sem antibiótico em cada alvéolo de uma nova placa de 12 poços e pré-aquecer a placa a 37 °C durante 30 min. Durante esta etapa, é importante utilizar soro fetal bovino livre de tetraciclinas contaminantes ou com nível muito baixo para interferir na indutibilidade.
- Prepare tubos de 1,5 mL contendo o plasmídeo com o GOI induzível (plasmídeo GOI) e o vetor regulador (por exemplo, pTet-Off) adicionando 1 μg de plasmídeo GOI e 1 μg de vetor regulador por poço em RT. Para experimentos de coexpressão com proteínas de ligação a RNA (RBP), 1 μg de um vetor constitutivo (por exemplo, pcDNA3) expressando o RPB de interesse é adicionado à mistura de DNA (Figura 4).
- Aspirar o meio e enxaguar suavemente as células com PBS (sem cálcio e magnésio) pré-aquecido a 37 °C.
- Adicione 5 mL de tripsina a 0,05% pré-aquecida a 37 ° C e incube as células até que as células estejam separadas (2-4 min). Neutralize a tripsina adicionando 10 mL de MEM completo sem antibiótico.
- Colete a suspensão celular em um tubo de 50 mL, lave a placa de Petri com 4 mL de meio para coletar o maior número possível de células restantes e, em seguida, centrifugue a suspensão celular a 300 x g por 5 min.
- Aspire e descarte suavemente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de PBS. Conte e calcule o número de células usando um hemocitômetro.
- Centrifugue as células a 300 x g por 5 min. Aspire suavemente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em tampão de ressuspensão a uma concentração de 4 x 107 células / mL. Adicione as células do tubo de 1,5 mL preparado na etapa 2.4 a uma concentração de 400.000 células por poço e misture-as delicadamente pipetando para cima e para baixo.
- Coloque o tubo no dispositivo de eletroporação e encha-o com 3,5 mL de tampão eletrolítico.
- Insira uma ponta de eletrodo banhada a ouro em uma pipeta pressionando completamente o pistão. Misture suavemente o conteúdo do tubo de 1,5 ml e aspire cuidadosamente as células com a pipeta. Tenha cuidado para evitar que bolhas de ar entrem na ponta, pois isso causará arco elétrico durante a eletroporação e levará à diminuição da eficiência da transfecção.
- Insira a pipeta na estação de eletroporação até ouvir um clique.
- Selecione o protocolo de eletroporação apropriado para células epiteliais alveolares, correspondendo a uma tensão de pulso de 1.450 V e 2 pulsos com largura de 20 ms, e pressione Iniciar na tela sensível ao toque.
- Imediatamente após a transfecção, retirar a pipeta e transferir as células para um alvéolo previamente preenchido com MEM completo sem antibiótico que tenha sido pré-aquecido a 37 °C.
- Repita as etapas 1.11-1.14 para as amostras restantes.
- Agite suavemente a placa para espalhar as células uniformemente sobre a superfície do poço. Incubar as células a 37 °C em 5% de CO2 em uma incubadora umidificada. Após 2 dias, substitua o meio por MEM completo com antibióticos.
- Confirme o sucesso da transfecção observando a expressão de eGFP em microscópio de fluorescência ou por citometria de fluxo usando um vetor controle (Figura 1).
nota: Esta etapa é opcional e requer uma etapa adicional de transfecção usando um plasmídeo diferente que expressa eGFP, como pcDNA3-EGFP.
2. Indução da inibição da transcrição do GOI
NOTA: As células podem ser pré-tratadas com os tratamentos desejados antes da indução da doxiciclina para avaliar seu impacto na estabilidade do mRNA (Figura 3).
- Prepare uma solução estoque de doxiciclina de 1 mg / mL em água deionizada. Conservar a solução-mãe a -20 °C e protegida da luz. A doxiciclina, um derivado da tetraciclina, é usada em vez da tetraciclina porque tem uma meia-vida mais longa (2x) do que a tetraciclina. Além disso, uma concentração menor de doxiciclina é necessária para a inativação completa do operon tet.
nota: A doxiciclina pode afetar a expressão de mRNA do GOI endógeno. Para verificar isso, o efeito de um tratamento de 24 horas com doxiciclina nas células alveolares deve ser testado para confirmar a ausência de quaisquer alterações na expressão do GOI (Figura 2).
- Prepare uma solução fresca de doxiciclina de 1 μg / mL em MEM completo 72 h após a transfecção e aqueça-a a 37 ° C.
- Substitua o meio por 1 mL de MEM completo contendo 1 μg / mL de doxiciclina por poço para inibir a transcrição do GOI.
- Incubar vários poços a 37 ° C em 5% de CO2 por diferentes períodos de tempo de 15 min-6 h para avaliar a meia-vida do mRNA do GOI.
- No final do tratamento, lave as células com PBS gelado e lise-as com um kit de extração de RNA de fenol-clorofórmio disponível comercialmente, adicionando 500 μL de tampão por poço e agitando a placa para homogeneizar as células.
- Isole o RNA de acordo com o protocolo do fabricante. Determinar o rendimento e a pureza do RNA por espectrofotometria a 230, 260 e 280 nm. Amostras de RNA com proporções de 260:230 e 260:280 de 1,8 e 2,0, respectivamente, são consideradas puras.
nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
