Transformação gênica baseada em vetor cromossômico artificial bacteriano binário em plantas de Arabidopsis: uma técnica para gerar plantas transgênicas com inserção de cópia única

Neste artigo

Resumo

Fonte: Tark-Dame, M., et al. Gerando plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW. J. Vis. Exp. (2018).

Neste vídeo, demonstramos a geração de plantas transgênicas de Arabidopsis expressando transgene estável por meio da transformação gênica baseada em cromossomos artificiais bacterianos binários mediada por Agrobacterium.

Protocolo

1. Arabidopsis Transformação

Prepare as plantas de Arabidopsis para a transformação.
1. Cultive plantas Arabidopsis em uma estufa ou câmara de crescimento climatizada até que estejam florescendo (12 vasos com 9 plantas cada por imersão).
2. Prenda os primeiros parafusos para permitir que mais parafusos secundários surjam. As plantas estão prontas para mergulhar 4–6 dias após o corte, quando as plantas têm muitas cabeças de flores imaturas e poucas sílicas fertilizadas.
Imersão floral
1. Mergulhe as inflorescências por 5 a 10 segundos em suspensão de Agrobacterium carregando T-DNA clonado com cromossomo artificial bacteriano binário ou BIBAC. Use agitação suave.
2. Enrole as partes acima do solo das plantas em filme plástico para manter a umidade alta e cubra os vasos com uma caixa para manter as plantas no escuro. Incube as plantas por 2 dias em uma estufa/câmara de crescimento.
3. Remova a caixa e o filme plástico e cultive as plantas até a maturidade em uma estufa/câmara de crescimento.
  nota: Para aumentar a eficiência da transformação, as mesmas plantas podem ser mergulhadas novamente 7 dias após a primeira imersão.
4. Colha as sementes. Agrupar e analisar as sementes (T1) de plantas, transformadas com o mesmo construto, como um único conjunto.
Rastreie as plantas transgénicas.
1. Para rastrear plantas transgênicas transformadas com um derivado pBIBAC-RFP-GW, analise as sementes usando microscopia de fluorescência. Para detectar a expressão de DsRed em tegumentos, imagine as sementes com uma excitação de 560 nm e emissão de 600–650 nm. Separe as sementes fluorescentes das não fluorescentes usando uma pinça.
2. Para rastrear plantas transgênicas transformadas com um derivado pBIBAC-BAR-GW, semeie as sementes em bandejas cheias de solo (~ 2.500 sementes / 0,1 m²). Para garantir uma distribuição uniforme das sementes em bandejas, suspenda as sementes em ágar 0,1% em meio Murashige Skoog 0,5x (MS) e espalhe as sementes usando uma pipeta de 1 mL.
  nota: Para estimular as sementes a germinar de forma síncrona, incubar as sementes durante pelo menos 2 dias a 4 °C. Isso pode ser feito antes ou depois de semear as sementes.
  1. Pulverize as mudas com solução de glufosinato-amônio a 0,5% 2 semanas e 3 semanas após a semeadura em bandejas. Use 500 mL de solução de glufosinato-amônio por 1 m².
  2. Transfira as mudas sobreviventes para vasos individuais. Uma imagem típica de uma bandeja com mudas antes e depois (segundo) do tratamento com glufosinato-amônio é mostrada na Figura 1.
  3. Analise as plantas resistentes ao glufosinato-amônio por PCR para a presença do construto de interesse.
    1. Isole o DNA genômico da planta para PCR.

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Resultados

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Figura 1: Bandeja preenchida com mudas de Arabidopsis antes e após o tratamento com glufosinato-amônio. As plântulas que não expressam o gene bar que está presente no t-DNA pBIBAC-BAR-GW morrem após serem pulverizadas com solução de glufosinato-amônio. As fotos mostram a mesma bandeja de mudas (A) antes da pulverização com Glufosinato-amônio, 14 dias após a semeadura, e (B) 10 dias depois, a...