Transformação gênica baseada em vetor cromossômico artificial bacteriano binário em plantas de Arabidopsis: uma técnica para gerar plantas transgênicas com inserção de cópia única

1. Arabidopsis Transformação

1. Prepare as plantas de Arabidopsis para a transformação.
   1. Cultive plantas Arabidopsis em uma estufa ou câmara de crescimento climatizada até que estejam florescendo (12 vasos com 9 plantas cada por imersão).
   2. Prenda os primeiros parafusos para permitir que mais parafusos secundários surjam. As plantas estão prontas para mergulhar 4–6 dias após o corte, quando as plantas têm muitas cabeças de flores imaturas e poucas sílicas fertilizadas.
2. Imersão floral
   1. Mergulhe as inflorescências por 5 a 10 segundos em suspensão de Agrobacterium carregando T-DNA clonado com cromossomo artificial bacteriano binário ou BIBAC. Use agitação suave.
   2. Enrole as partes acima do solo das plantas em filme plástico para manter a umidade alta e cubra os vasos com uma caixa para manter as plantas no escuro. Incube as plantas por 2 dias em uma estufa/câmara de crescimento.
   3. Remova a caixa e o filme plástico e cultive as plantas até a maturidade em uma estufa/câmara de crescimento.
      nota: Para aumentar a eficiência da transformação, as mesmas plantas podem ser mergulhadas novamente 7 dias após a primeira imersão.
   4. Colha as sementes. Agrupar e analisar as sementes (T1) de plantas, transformadas com o mesmo construto, como um único conjunto.
3. Rastreie as plantas transgénicas.
   1. Para rastrear plantas transgênicas transformadas com um derivado pBIBAC-RFP-GW, analise as sementes usando microscopia de fluorescência. Para detectar a expressão de DsRed em tegumentos, imagine as sementes com uma excitação de 560 nm e emissão de 600–650 nm. Separe as sementes fluorescentes das não fluorescentes usando uma pinça.
   2. Para rastrear plantas transgênicas transformadas com um derivado pBIBAC-BAR-GW, semeie as sementes em bandejas cheias de solo (~ 2.500 sementes / 0,1 m²). Para garantir uma distribuição uniforme das sementes em bandejas, suspenda as sementes em ágar 0,1% em meio Murashige Skoog 0,5x (MS) e espalhe as sementes usando uma pipeta de 1 mL.
      nota: Para estimular as sementes a germinar de forma síncrona, incubar as sementes durante pelo menos 2 dias a 4 °C. Isso pode ser feito antes ou depois de semear as sementes.
      1. Pulverize as mudas com solução de glufosinato-amônio a 0,5% 2 semanas e 3 semanas após a semeadura em bandejas. Use 500 mL de solução de glufosinato-amônio por 1 m².
      2. Transfira as mudas sobreviventes para vasos individuais. Uma imagem típica de uma bandeja com mudas antes e depois (segundo) do tratamento com glufosinato-amônio é mostrada na Figura 1.
      3. Analise as plantas resistentes ao glufosinato-amônio por PCR para a presença do construto de interesse.
         1. Isole o DNA genômico da planta para PCR.

Figura 1: Bandeja preenchida com mudas de Arabidopsis antes e após o tratamento com glufosinato-amônio. As plântulas que não expressam o gene bar que está presente no t-DNA pBIBAC-BAR-GW morrem após serem pulverizadas com solução de glufosinato-amônio. As fotos mostram a mesma bandeja de mudas (A) antes da pulverização com Glufosinato-amônio, 14 dias após a semeadura, e (B) 10 dias depois, após serem pulverizadas duas vezes.