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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Desenho de oligo morfolino
NOTA: As sequências para A. mexicanus estão disponíveis através do National Center of Biotechnology Information (NCBI) Gene e NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), bem como do navegador de genoma Ensembl (https://www.ensembl.org). Ao projetar um morfolino para uso em formas de superfície e caverna, é fundamental identificar qualquer variação genética entre os morfos neste estágio, para que essas regiões genéticas possam ser evitadas como alvos para morfolinos. Qualquer variação polimórfica dentro de um local-alvo morfolino pode levar a uma ligação ineficaz. O design é semelhante a outros sistemas de peixes, como o peixe-zebra, e já demonstrou funcionar de forma eficaz em A. mexicanus.
- Desenho de morfolinos bloqueadores de tradução
nota: Os morfolinos bloqueadores de tradução bloqueiam a tradução ligando-se ao local de início endógeno e impedem que a maquinaria translacional se ligue à sequência de mRNA por meio de impedimento estérico.
1. Identifique a região codificadora do gene alvo começando com o local de início do ATG.
2. Registre os primeiros 25 pares de bases da sequência de destino copiando e colando a sequência em um editor de texto ou caderno de laboratório.
3. Usando software online (por exemplo, http://reverse-complement.com) ou tradução manual, gere o complemento reverso da sequência alvo. Salve o complemento reverso resultante em um editor de texto ou caderno de laboratório.
4. Encomende um morfolino com a sequência do complemento reverso de uma empresa que gera oligonucleotídeos morfolinos. Consulte Tabela de Materiais para empresas.
2. Microinjeções
- Preparação de ferramentas gerais para injeções
nota: Os procedimentos nesta seção foram descritos em detalhes em outro lugar, e uma visão geral com pequenas modificações é apresentada aqui.
- Gere placas de injeção despejando agarose morna a 3% dissolvida na água do sistema de peixes em uma placa de Petri de 100 mL. Coloque cuidadosamente um molde de injeção de ovo na agarose recém-derramada para fazer poços para as ovas de peixe. Coloque a lateral do molde em ágar em um ângulo de 45 ° e, em seguida, abaixe-o lentamente na agarose; Abaixar lentamente o molde em um ângulo evita que o ar fique preso embaixo do molde. Remova suavemente o molde assim que a agarose estiver solidificada. As placas podem ser armazenadas, seladas, a 4 °C por até 1 semana.
- Coleta de ovos de estágio unicelular
- Na noite em que a reprodução é esperada, examine os tanques a cada 15 a 30 minutos e monitore os ovos no fundo do tanque. Os ovos parecem translúcidos, medindo aproximadamente 1 mm de diâmetro.
- Use uma rede de pesca de malha fina para coletar os ovos e transferi-los para uma tigela de vidro cheia de água fresca do sistema de peixes. Examine os ovos ao microscópio para confirmar se os ovos estão no estágio de uma célula.
- Usando pipetas de vidro, transfira os ovos unicelulares para as placas de injeção. Pipetas de vidro são necessárias nesta fase, pois os ovos grudam no plástico.
- Utilizando uma pipeta, libertar cuidadosamente os ovos nos alvéolos da placa de injecção de agarose do ponto 2.1. Encha as fileiras da placa de injeção pré-aquecida (à temperatura ambiente) com o número máximo de ovos (30–40 por fileira e até cinco fileiras). Fileiras completas ajudam a evitar que os óvulos se movam durante as injeções. Mantenha os ovos hidratados na placa de injeção com uma pequena quantidade de água do sistema de peixes até a realização das injeções.
- Configuração de pico-injeção e diretrizes gerais de otimização de injeção
- Preencha as agulhas de injeção usando ponteiras de pipeta de carregamento de gel que se encaixam dentro do capilar ou usando ponteiras de micropipeta padrão e adicionando um bolus de 2 a 4 μL até a extremidade. Assim que a agulha estiver cheia, use uma pinça para aparar o excesso de comprimento da agulha de injeção.
- Realize microinjeções usando uma agulha montada em um micromanipulador, conectada a um microinjetor de picolitro.
- Defina o tempo de injeção para 0,03 s e a pressão para ~0,0 psi. A pressão de injeção varia de acordo com pequenas diferenças entre as agulhas, portanto, otimize para obter um bolus de injeção de ~ 1,0 nL.
nota: A pressão de injeção geralmente está na faixa de ~ 10–30 psi.
- Padronize o bolus de injeção injetando em óleo mineral e medindo o tamanho do bolus com um micrômetro de lâmina para atingir um volume de injeção de ~ 1–1,5 nL. Ajuste a pressão de injeção (psi) para aumentar ou diminuir o volume do bolus.
- Retire a água do topo dos ovos usando um lenço de laboratório.
nota: O córion de ovo de Astyanax é um pouco mais difícil de penetrar do que os ovos de peixe-zebra. Descobrimos que retirar a água da parte superior dos ovos ajuda a facilitar a penetração da agulha no ovo. A otimização da placa pode permitir ~ 200 ovos em uma única placa.
- Use o micromanipulador para penetrar em cada ovo com a agulha e injete-o diretamente na gema. Uma vez posicionado na gema, injete o ovo pressionando o botão de injeção ou o pedal de injeção.
nota: Uma placa cheia pode ser injetada em ~15 min. O estágio de célula única dura ~ 40 min.
- Injeção de morfolinos
nota: A quantidade de morfolino necessária para o knockdown sem causar toxicidade precisará ser otimizada por gene alvo; No entanto, uma concentração de 400 pg é um bom lugar para começar.
- Prepare o morfolino para que 400 pg de morfolino sejam injetados por ovo. Descongele o morfolino no gelo. A solução injetável é composta por morfolino (na concentração desejada), H2O livre de RNase ou solução de Danieau e vermelho de fenol (10% do volume final). Para obter um exemplo, consulte a Tabela 1.
- Injetar 1 nL por embrião.