Transgênese de peixe-zebra mediada por transposon Tol2: um procedimento para gerar peixe-zebra transgênico após a coinjeção do sistema Tol2 em embriões de peixe-zebra fertilizados

Resumo

Fonte: Silic, M. R., et al. Visualização da Atividade Elétrica Celular em Embriões e Tumores Iniciais de Peixe-Zebra. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, demonstramos um procedimento para gerar uma linha transgênica estável de peixe-zebra expressando constitutivamente uma proteína indicadora de voltagem fluorescente após a co-injeção do sistema de transposons Tol2 compreendendo a construção de mRNA de transposase e transon Tol2 que codifica o indicador de voltagem fluorescente.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Microinjeção

1. Configure 4-6 tanques de reprodução com pelo menos 2 machos e 2 fêmeas na tarde anterior à injeção. Esses peixes não devem ser alimentados à tarde. Esta etapa reduzirá a quantidade de resíduos de peixes e economizará tempo para limpá-los na manhã seguinte, além de ajudar a induzir uma resposta reprodutiva.
2. Na manhã seguinte, remova a solução de injeção preparada composta por: (i) uma construção de transposon Tol2 contendo um promotor de ubiquitina de peixe-zebra e o gene indicador de voltagem fluorescente Sensor Acelerado de Potenciais de Ação 1 (ASAP1) e (ii) mRNA de Tol2, do freezer a -80 ° C, e coloque-o no gelo.
3. Puxe as divisórias nos tanques de criação de peixes e deixe os peixes acasalarem. Em geral, os peixes põem ovos dentro de 20 a 30 minutos após retirar a divisória. Caso contrário, espere mais 1-2 horas. Alguns peixes podem não botar ovos. Neste caso, repita este experimento para coleta de embriões de peixes.
4. Enquanto espera, certifique-se de que haja agulhas preparadas com a ponta quebrada em um ângulo criando uma borda chanfrada com uma pinça ou quebrando em um limpador de tarefa delicado.
   1. Puxe as agulhas do vidro capilar em um extrator de micropipeta usando os seguintes parâmetros: calor 545; tração 60; velocidade 80; tempo 250; pressão 500. Quebre a agulha com uma pinça embaixo de uma luneta de dissecção (com régua ocular para estimativa do diâmetro) segurando a pinça em um ângulo de aproximadamente 45°. Os diâmetros desejados da agulha podem ser variáveis dependendo das configurações do microinjetor, mas um diâmetro menor é preferido para diminuir a mortalidade embrionária.
5. Depois que os peixes botarem ovos, colete-os em uma placa de Petri de 10 cm de diâmetro e leve-os para a dissecação. Remova todos os embriões anormais e resíduos de peixes.
6. Pipetar os embriões fertilizados no molde de injeção de agarose a 3% preparado. Remova o excesso de água para ajudar a manter os embriões no lugar.
7. Uma vez que todas as fileiras estejam cheias de embriões viáveis, organize-as de forma que todas as células individuais estejam voltadas para a mesma direção em direção à agulha, que é um ângulo de cerca de 45° horizontalmente. Isso tornará a injeção muito mais fácil mais tarde.
8. Enquanto estiver usando luvas, use uma ponta de pipeta de carga de 20 μL e remova 5 μL da construção preparada do tubo no gelo.
9. Insira cuidadosamente a ponta na extremidade traseira do tubo capilar quebrado até onde ele começa a bater, para que o reagente fique o mais próximo possível da ponta. Se ainda houver bolhas de ar, agite a agulha, tomando cuidado para não quebrar a ponta.
10. Insira a agulha diretamente no porta-agulha de microinjeção e aperte cuidadosamente até que a agulha permaneça no lugar. Ajuste o ângulo para cerca de 45°.
11. Depois que a agulha estiver preparada e conectada, ligue o microscópio e o tanque de pressão de gás. Os tanques comerciais de CO₂ geralmente são bons para esse fim. O volume de injeção é ajustado pela pressão de retenção e ejeção: aproximadamente 0,5 psi para retenção e 30 psi para ejeção. Certifique-se de verificar se a solução sai ao pressionar o pedal.
12. Usando um micrômetro de estágio com uma gota de óleo mineral, ajuste o volume e o fluxo da solução para ~ 150 μm de diâmetro (cerca de 2 nL). Certifique-se de que a contrapressão deixe uma pequena quantidade escorrer da agulha. Se não houver contrapressão suficiente, a ação capilar fará com que o líquido entre na agulha e destrua o mRNA.
13. Uma vez calibrada a agulha, comece a injetar a construção na única célula dos embriões fertilizados.
    nota: Isso requer muita prática, paciência e sutileza, devido à membrana celular ser difícil de perfurar. É importante injetar a solução na célula, não na gema, para gerar peixes-zebra transgênicos. Isso é diferente da injeção de morfolino. Não importa de que lado a agulha entra na célula, desde que a construção entre na célula. A transgênese terá uma taxa de sucesso muito baixa se injetada na gema em vez da célula. A injeção de estágio de célula única também é importante, ou peixes quimera somáticos serão criados. Isso reduzirá a chance de o transgene entrar nas células germinativas.
14. Use a borda do entalhe de gel para fornecer um suporte que mantenha o embrião no lugar e permita que a agulha aplique pressão sem mover o embrião. Assim que a ponta da agulha estiver na célula única, pressione o pedal para liberar a quantidade desejada de solução. Repita esse processo para todos os embriões.
15. Quando concluído, transfira os embriões injetados para um prato rotulado, enxaguando-os do entalhe de agarose com água do sistema de peixes e uma pipeta de transferência descartável de 3,4 mL. Armazene os embriões em uma incubadora a 28,5 °C para deixá-los se desenvolver.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágagose RA	Amresco	N605-500G	Para fazer os géis de injeção
Escopo de dissecção de campo claro	Nikon	SMZ 745	Decorionação, microinjeção, montagem
Pipeta de transferência descartável 3,4 ml	Thermo Científico	13-711-9AM	Embriões de peixes e transferência de água
Fórceps #5	WPI	500342	Decorionação e quebra de agulha
Ponta de carregamento	Eppendorf	930001007	Para carregar a solução de injeção em agulhas capilares
Molde de microinjeção	Ferramentas científicas adaptativas	TU-1	Para preparar a bandeja de molde de agaorse para segurar embriões de peixe durante a injeção
Microinjetor	WPI	Picopump pneumático PV820	Injetor de microinjeção
Micro-manipulador	WPI	Microinjetor MM3301R	Operação de microinjeção
Extrator de micropipetas	Instrumento Sutter	P-1000	Para preparar agulha capilar
Óleo mineral	Amresco	J217-500ml	Para calibrar o volume de injeção
Placas de Petri de plástico	VWR	Rolamento 25384-088	Para segurar peixes ou embriões de peixes durante o processo de imagem
Micrômetro de palco	Escopo Am	MR100	Calibração do volume de microinjeção
Capilares de vidro de parede fina	WPI	TW100F-4	Vidro cru para fazer agulha cappilar