Edição de genes mediada por transposon PiggyBac em iPSCs humanas: um procedimento para integrar gene de interesse em iPSCs humanas usando o sistema de transposon PiggyBac

Resumo

Fonte: Garone, M. G. et al. Conversão de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) em neurônios motores espinhais e cranianos funcionais usando vetores PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o procedimento para gerar neurônios motores por transfecção de iPSCs humanas com sistema de transposons PiggyBac pela expressão ectópica de fatores de transcrição específicos da linhagem.

Protocolo

1. Geração de linhas iPSC induzíveis por NIL e NIP

1. Transfecção celular
   1. Enxágue as células com PBS (livre de Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. Adicionar o reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) (0,35 ml para uma placa de 35 mm) e incubar a 37 °C até que as células individuais sejam
   3. separado (5-10 min).
   4. Complete suavemente a separação celular pipetando para cima e para baixo com um pipetador P1000 3-4 vezes.
   5. Colete em um tubo de 15 mL e adicione PBS (Ca^2+/Mg²⁺ livre) a 10 mL. Conte as células.
   6. Pellet 10⁶ células e ressuspender em 100 μl de tampão R (incluído no kit de eletroporação de células, consulte a Tabela de Materiais).
   7. Adicionar DNA plasmidial para transfecção: 4,5 μg de vetor transponível (epB-Bsd-TT-NIL ou epB-Bsd-TT-NIP) e 0,5 μg do plasmídeo piggyBac transposase.
   8. Transfect com o sistema de eletroporação de células (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante com os seguintes parâmetros: tensão de 1.200 V, largura de 30 ms, 1 pulso. Semeie as células em meio iPSC humano suplementado com 10 μM de Y-27632 (inibidor de ROCK, consulte Tabela de Materiais) em um prato revestido com matriz de 6 mm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Suplemento sem soro para manutenção das células neuronais
Bambanker	Genética da Nippon	NGE-BB02	Meio de congelamento celular para progenitores de neurônios motores
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	Produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
Matriz qualificada para hESC da Corning Matrigel	Corning	354277	Preparação da membrana basal reconstituída a partir do sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Usado para adesão de iPSC a suportes de plástico e vidro
MEIO DE CONGELAMENTO ACF CRIOSTEM	Indústrias Biológicas	05-710-1E	Meio de congelamento para iPSCs humanas
Exibir	Gibco	Rolamento 17105-041	Reagente para dissociação suave de iPSCs humanas
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Meio basal para cultura de células
Doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Usado para induzir a expressão de transgenes dos vetores epB-Bsd-TT-NIL e epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Linha iPSC humana comercial
GDNF	Tecnologia PreproTech	450-10	Fator neurotrófico derivado da glia
Linha HiPSC Episómal Gibco	Thermo Fisher Científico	A18945	Linha iPSC humana comercial
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	Produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
Laminina	Sigma-Aldrich	11243217001	Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro
NEAA	Thermo Fisher Científico	11140035	Aminoácidos não essenciais. Usado como suplemento para meio de cultura celular, para aumentar o crescimento e a viabilidade celular.
Kit Neon 100 μL	Thermo Fisher Científico	MPK10096	Kit de eletroporação de células
Sistema de transfecção de néon	Thermo Fisher Científico	MPK5000	Sistema de eletroporação de células
Meio Neurobasal	Thermo Fisher Científico	21103049	Meio basal projetado para manutenção e maturação de longo prazo de populações de células neuronais sem a necessidade de uma camada alimentadora de astrócitos
NutriStem-XF/FF	Indústrias Biológicas	05-100-1A	Meio de cultura iPSC humano
PBS Ca2+/Mg2+ livre	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Tampão de fosfato salino de Dulbecco, sem cálcio, sem magnésio
Penicilina/estreptomicina	Sigma-Aldrich	Pág. 4333-100ML	Solução de penicilina/estreptomicina usada para prevenir a contaminação da cultura de células por bactérias.
Y-27632 (inibidor de ROCK)	Enzo Ciências da Vida	ALX-270-333-M005	Inibidor seletivo permeável à célula da proteína quinase (ROCK) contendo bobina enrolada associada a Rho. Aumenta a sobrevivência do iPSC