Carregamento de esferas para introduzir ácidos nucléicos em células cultivadas aderentes: uma técnica para carregar plasmídeos codificadores de proteínas fluorescentes em células de mamíferos aderentes

Resumo

Fonte: Cialek, C. A. et al. Proteínas de carregamento de esferas e ácidos nucléicos em células humanas aderentes. J. Vis. Exp. (2021).

Neste vídeo, descrevemos o procedimento para introduzir ácidos nucléicos em células de mamíferos aderentes usando o carregamento de contas.

Protocolo

1. Células de carregamento de esferas

NOTA: Se necessário, lave as células brevemente com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, adicione 2 mL do meio ideal. Incubar durante pelo menos 30 min.

1. Faça uma solução de 3-8 μL contendo os plasmídeos, proteínas e/ou partículas desejados. Use ~ 1 μg (0,1-1 pmol) de cada tipo de plasmídeo e ~ 0,5 μg (0,01 nmol) de proteína, dependendo dos requisitos experimentais. Use um tubo de baixa retenção para proteínas, para que elas não sejam deixadas para trás nas paredes do tubo. Traga a solução até um mínimo de 3 μL com PBS e ajuste o volume da solução para revestir toda a área das células a serem carregadas (ou seja, o micropoço da câmara, Figura 1B).
2. Misture bem a solução pipetando para cima e para baixo e / ou sacudindo o tubo. Gire brevemente a solução até o fundo do tubo em uma microcentrífuga de mesa.
3. Transfira a solução de carregamento de grânulos e a câmara de células para uma capa de cultura de tecidos. Execute as etapas restantes na capa de cultura de tecidos usando a técnica estéril.
4. Remova o meio das células e armazene-o temporariamente em um tubo estéril. Aspire suavemente todo o meio ao redor das bordas da câmara e incline a câmara em um ângulo de aproximadamente 45° e remova a gota restante do meio no micropoço central. Durante a remoção do meio, certifique-se de evitar que a ponta da pipeta toque no vidro, o que pode resultar em descamação e perda de células. Passe rapidamente para a próxima etapa para que as células não fiquem secas por muito tempo.
5. Pipete suavemente a solução de carregamento de esferas no micropoço de vidro no centro da câmara. Opcional: Incube com balanço suave por ~ 30 s sem permitir que a câmara seque completamente.
6. Disperse suavemente uma monocamada de esferas de vidro no topo das células, de preferência usando um aparelho de carregamento de esferas (Figura 1A). Certifique-se de que as esferas cubram completamente as células do micropoço com fundo de vidro.
7. Apertando a câmara com dois dedos, bata-a contra a superfície do capuz levantando-a ~ 2 polegadas e abaixando-a com firmeza. Use uma força aproximadamente equivalente a deixar cair o prato dessa altura. Repita para um total de ~10 toques.
   nota: Certifique-se de que as torneiras não descasquem substancialmente as células. O rosqueamento pode ser otimizado para o tipo de célula. Se as células carregarem mal, bata com mais força; no entanto, se muitas células se soltarem, bata mais levemente.
8. Adicione delicadamente o meio de volta à câmara, pipetando lentamente no lado plástico da câmara. Tente aspirar quaisquer contas flutuantes sem perturbar as células. Adicione mais mídia pré-aquecida nesta etapa se muito tiver sido removido. Incube as células por 0,5-2 h na incubadora.

Resultados

Figura 1: Aparelho, técnica e linha do tempo de carregamento de contas

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura de células de 10 cm	VWR	82050-916	Use para cultivar células
Placas de cultura de células de 35 mm	falcão	353001	Use para construir carregador de contas
Câmara de células Attofluor	Thermo Fisher Científico	Rolamento A7816	Use para construir o carregador de contas personalizado
DMEM, glicose alta, sem glutamina	Thermo Fisher Científico	11960069	Uso em cultura de células em geral
Pratos com fundo de vidro, 35 mm, #1,5, vidro de 14 mm	Corporação MatTek	P35G-1.5-14-C	Células-semente nessas câmaras para imagens
Contas de vidro, lavadas com ácido, ≤106 μm	Millipore Sigma	G4649	Polvilhe nas células para carregar o DNA e as proteínas do plasmídeo
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Thermo Fisher Científico	AM9625	Estoque de trabalho de 1X PBS estéril
DMEM sem fenol	Thermo Fisher Científico	31053036	Use em células antes da imagem
Opti-MEM, meio de soro reduzido	Thermo Fisher Científico	31985070	Meios ideais para incubação de células antes do carregamento do grânulo (etapa opcional)