1. Trate camundongos neonatais com rAAV9 em P0,5-P2,5 por injeção subcutânea.
<ol>
	<li>Pré-encha uma seringa de insulina 29G1/2, 0,33 x 12,7 mm com a solução recombinante de vírus adeno-associado 9 (rAAV9). Tenha cuidado para remover bolhas de ar.</li>
	<li>Segure o filhote crio-anestesiado em uma mão com o polegar e o indicador. Antes da injeção, passe a pele das costas do filhote com um cotonete saturado com álcool isopropílico 70% para manter a condição estéril. Insira a agulha da seringa na subcutânea ântero-dorsal do animal em um ângulo de 5 a 10°. Injetar 50-70 μl da solução de rAAV9 utilizando a seringa de insulina. 
	NOTA: O rAAV9 também pode ser administrado ao camundongo por injeção intraperitoneal ou intravenosa. A expressão eficiente dos genes entregues no coração pode ser obtida. No entanto, a injeção intraperitoneal às vezes pode resultar em expressão de vazamento no fígado. Após a injeção, a condição dos filhotes foi monitorada todos os dias.</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>vetor rAAV9 </td>
			<td>Núcleo do vetor de Penn </td>
			<td>Pág. 1967</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

entrega de genes baseada em vírus adeno-associados recombinantes: uma técnica para entrega de transgenes e expressão cardíaca específica em modelo de roedor

Recombinant Adeno Associated Virus Based Gene Delivery: A Technique for Transgene Delivery and Cardiac-Specific Expression in Rodent Model

Fonte: Ding, J. et al. <a href="https://www.jove.com/v/54787">Preparação de rAAV9 para superexpressar ou derrubar genes em corações de camundongos.</a> J. Vis. Exp. (2016)
Neste vídeo, demonstramos a entrega de genes baseados em adenovírus associados recombinantes no filhote de camundongo. Este método ajuda no estudo da expressão gênica nas células-alvo.

Entrega de genes baseada em vírus adeno-associados recombinantes: uma técnica para entrega de transgenes e expressão cardíaca específica em modelo de roedor

Fonte: Ding, J. et al. Preparação de rAAV9 para superexpressar ou derrubar genes em corações de camundongos. J. Vis. Exp. (2016)
Neste vídeo, demonstramos ...

O vírus adeno-associado recombinante, rAAV, é um pequeno vírus de DNA de fita simples geneticamente modificado para atingir um tipo específico de célula e transportar sua carga genética para o núcleo da célula hospedeira para expressão gênica.
Comece restringindo um filhote de camundongo crio-anestesiado. Esterilize a pele posterior e injete subcutaneamente o vetor rAAV carregando o transgene desejado ao longo de um promotor cardíaco específico. O vetor é absorvido pelo sistema vascular e atinge órgãos distantes, incluindo o coração.
Aqui, o vírus recombinante se liga à superfície do cardiomiócito e é internalizado via endocitose em um endossomo. Dentro do endossomo, o capsídeo viral se desmonta parcialmente, expondo as proteínas líticas virais. Essa proteína induz poros na membrana endossômica, através dos quais o vetor escapa para o citoplasma.
O vetor viaja através dos microtúbulos citoplasmáticos e entra pelo poro nuclear. Uma vez no núcleo, o capsídeo viral se desmonta para liberar seu genoma. O DNA de fita simples que carrega o gene alvo é então convertido em DNA de fita dupla.
Após a transcrição do DNA, o mRNA produzido se move para o citoplasma. Aqui, o mRNA sofre tradução, expressando a proteína alvo nos cardiomiócitos. Observe amostras de tecido de diferentes órgãos sob um microscópio de fluorescência para determinar a eficiência e a especificidade do tecido da entrega do gene ao coração.

Depois de determinar o título viral de acordo com o protocolo de texto, prepare soluções de trabalho rAAV9 com títulos de vírus de 1-7 x 1012 partículas por mililitro. Para tratar camundongos neonatais, use a solução rAAV9 para pré-encher uma seringa de insulina de 0,33 x 12,7 mililitros com uma agulha de calibre 29 de 1/2 polegada, evitando bolhas de ar.
Depois de crioanestesiar um filhote, segure-o em uma mão com o polegar e o indicador. Em seguida, passe a pele da parte de trás do filhote com um cotonete saturado com álcool isopropílico a 70%. Insira a agulha da seringa na subcutânea ântero-dorsal do animal em um ângulo de 5 a 10 graus antes de injetar 50 a 70 microlitros da solução de rAAV9.

recombinant-adeno-associated-virus-based-gene-delivery-technique-for

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Técnicas Biológicas

Gene Transfer Techniques

Técnicas de Transferência de Genes

Transduction

Transdução

2.9K visualizações. O vírus adeno-associado recombinante, rAAV, é um pequeno vírus de DNA de fita simples geneticamente modificado para atingir um tipo específico de célula e transportar sua carga genética para o núcleo da célula hospedeira para expressão gênica. Comece restringindo um filhote de camundongo crio-anestesiado. Esterilize a pele posterior e injete subcutaneamente o vetor rAAV carregando o transgene desejado ao longo de um promotor cardíaco específico. O vetor é absorvido pelo si...

Entrega de genes baseada em vírus adeno-associados recombinantes: uma técnica para entrega de transgenes e expressão cardíaca específica em modelo de roedor

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