Entrega baseada em nanolâminas de carga de ácido nucleico: uma técnica para entregar o complexo Cas9-sgRNA às células-alvo por meio de partículas semelhantes a vírus

Resumo

Fonte: Mangeot, P. E., et al. Entrega do Complexo de Ribonucleoproteína Cas9/sgRNA em Células Imortalizadas e Primárias por Meio de Partículas Semelhantes a Vírus ("Nanoblades"). J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra uma técnica para entrega baseada em nanolâminas do complexo ribonucleoproteína Cas9-sgRNA dentro de células-alvo para edição do genoma. As nanolâminas são partículas semelhantes a vírus desprovidas da capacidade de se multiplicar e infectar células vizinhas, portanto, são muito úteis para o transporte rápido e dependente da dose de bio e nanomateriais.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Desenho e clonagem de sgRNA

NOTA: As diretrizes para o projeto de sgRNAs podem ser obtidas de várias fontes, como https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing ou de Hanna e Doench.

1. Uma vez que as sequências de sgRNA de 20 nucleotídeos tenham sido projetadas, solicite os seguintes oligonucleotídeos de DNA de fita simples:
   1. Forward: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N corresponde ao locus alvo sem a sequência do motivo adjacente ao protoespaçador (PAM))
   2. Reverso: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 3' (N correspondem ao complemento reverso do locus alvo sem a sequência PAM)
      nota: Nenhuma modificação especial é necessária ao solicitar os oligonucleotídeos (sem necessidade de fosfato 5').
2. Hibridizar os dois oligonucleotídeos de DNA em um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR) de 0,2 mL misturando 5 μL de tampão de recozimento (500 mM de NaCl; 100 mM de Tris-HCl; 100 mM de MgCl2; 10 mM de DTT; pH 7,9 a 25 ° C), 1 μL de cada oligonucleotídeo de DNA (100 μM de solução estoque em água) e 42 μL de água.
3. Em um bloco de PCR, incubar amostras a 95 °C por 15 s e, em seguida, diminuir a temperatura para 20 °C com uma rampa de 0,5 °C/s. Manter em temperatura ambiente ou armazenar a -20 °C.
   nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
4. Digerir 10 μg dos plasmídeos de expressão de sgRNA BLADE ou SUPERBLADE com 10 unidades de enzima de restrição BsmBI-v2 durante 3 h a 55 °C num volume total de reação de 50 μL.
   nota: O vetor digerido deve liberar uma inserção de DNA de ~ 1,9 kb e um segundo fragmento de DNA de ~ 3,3 kb.
5. Carregue a reação de restrição em um gel de agarose a 1% corado com 5 μg/mL de brometo de etídio (ou um corante de gel de DNA alternativo mais seguro).
   nota: Use equipamento de proteção adequado ao manipular o brometo de etídio, que é suspeito de causar defeitos genéticos.
   1. Em uma mesa ultravioleta (UV) ajustada em um comprimento de onda de 312 nm (para evitar danos ao DNA), corte o fragmento de DNA de 3,3 kb do gel e coloque-o em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      NOTA: Use equipamento de proteção adequado (luvas e óculos de proteção UV) ao manipular o brometo de etídio e trabalhar na mesa UV.
   2. Extraia o DNA do gel fatiado contendo o fragmento de DNA de 3,3 kb usando um kit de extração de gel de DNA dedicado (consulte a Tabela de Materiais). Quantificar a quantidade de DNA purificado usando um espectrofotômetro.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
6. Ligue os oligonucleotídeos de DNA híbridos diretos e reversos da etapa 1.2 para o vetor BLADES ou SUPERBLADE purificado por gel digerido por BsmB1 da etapa 1.5.2. Para isso, adicione 2 μL de tampão T4 DNA ligase, 50 ng do vetor purificado em gel (da etapa 1.5.2), 1 μL dos oligonucleotídeos de DNA hibridizados (da etapa 1.2), água para perfazer o volume de 19 μL e 1 μL de T4 DNA ligase. Incubar a reação a 25 °C durante 10 min.
   1. Transforme o produto de ligação em bactérias competentes (consulte a Tabela de Materiais). Colocar as bactérias transformadas numa placa de ágar ampicilina Luria Bertani e incubar durante a noite a 37 °C.
   2. Selecione várias colônias isoladas na placa de ágar para realizar a minipreparação de DNA (consulte a Tabela de Materiais) e execute o sequenciamento de Sanger usando um primer direto U6 (5 'GACTATCATATGCTTACCGT 3') para verificar a ligação correta da sequência variável de sgRNA.
      NOTA: Outros plasmídeos de expressão de sgRNA podem ser usados se não codificarem a proteína Cas9, o que pode interferir na produção de Nanoblade.

2. Preparação de plasmídeo

1. Efectuar a maxipreparação (ver Tabela de Materiais) de todos os plasmídeos necessários e preparar alíquotas de 10 μg a 1 μg/ml para armazenar a -20 °C. Evitar ciclos repetidos de congelamento/descongelamento dos plasmídeos; utilizar alíquotas duas vezes antes de as eliminar.

3. Preparação de nanolâminas

1. No Dia 1, semeie entre 3,5 e 4 × 10⁶ HEK293T células (consulte a Tabela de Materiais) em 10 mL do meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo glicose alta, piruvato de sódio, L-glutamina, 10% de soro fetal bovino (FBS) e penicilina/estreptomicina em uma placa de cultura de células de 10 cm. Mova a placa de 10 cm suavemente para trás e para a frente, depois da direita para a esquerda (repita esta sequência 5x) para distribuir as células de forma homogênea sobre a placa de cultura. Incubar células a 37 °C em uma incubadora de células com 5% de CO₂,
   nota: Todos os procedimentos relacionados ao manuseio de células cultivadas e nanolâminas devem ser realizados sob uma capela de fluxo laminar de cultura de células para evitar sua contaminação.
2. Dia 2: Transfecção de plasmídeo
   1. As células devem ser 70-80% confluentes 24 h após o plaqueamento (Figura 1A). Substitua o meio por 10 mL de DMEM fresco contendo glicose alta, piruvato de sódio, L-glutamina, FBS a 10% (penicilina e estreptomicina podem ser omitidas, embora não seja obrigatório) antes da transfecção.
      NOTA: Nesta etapa, é importante que as células não sejam confluentes. Caso contrário, a eficiência da transfecção, bem como a produção de partículas, podem ser reduzidas.
   2. Para cada placa de 10 cm, preparar as seguintes quantidades de plasmídeos num tubo de 1,5 ml: 0,3 μg de pCMV-VSV-G, 0,7 μg de pBaEVRless, 2,7 μg de MLV Gag/Pol, 1,7 μg de BIC-Gag-Cas9, 4,4 μg de plasmídeo BLADES ou SUPERBLADES que codifica o sgRNA clonado (ou 2,2 μg cada se utilizar dois sgRNAs).
   3. Adicione 500 μL de tampão de transfecção (consulte a Tabela de Materiais), vortex por 10 s e, em seguida, centrifugue por 1 s. Adicione 20 μL do reagente de transfecção (consulte a Tabela de Materiais), vortex o tubo por 1 s e centrifugue por 1 s.
   4. Incubar durante 10 min à temperatura ambiente e adicionar toda a solução gota a gota às células em meio DMEM utilizando um pipetador P1000. Mova a placa de 10 cm suavemente para trás e para frente, depois da direita para a esquerda (repita esta sequência 5x) para distribuir uniformemente o reagente de transfecção sobre as células. Incubar células a 37 °C por pelo menos 40 h em uma incubadora de células com 5% de CO₂.
      nota: Se desejado, o meio pode ser trocado 4 h após a transfecção.
3. No dia 3, verifique a morfologia das células transfectadas ao microscópio.
   nota: As células produtoras começarão a se fundir. Esta é uma ocorrência normal devido à expressão de envelopes virais fusogênicos (Figura 1B, C).
4. Dia 4: Colhendo Nanoblades
   nota: Pelo menos 40 h após a transfecção, as células teriam se fundido devido à expressão dos envelopes virais fusogênicos e, às vezes, as células estão completamente separadas do suporte da placa (Figura 1D).
   1. Colete 9 mL do sobrenadante do meio de cultura usando uma pipeta de 10 mL.
      nota: Nanoblades são VLPs capazes de entregar a proteína Cas9 e seu sgRNA associado em células primárias e in vivo. Embora não sejam considerados organismos geneticamente modificados, pois são desprovidos de material genético, podem induzir alterações genéticas. Portanto, eles devem ser manipulados com cautela para evitar qualquer contato com os usuários (especialmente se forem programados para atingir genes supressores de tumor). Os usuários são aconselhados a seguir as diretrizes de segurança locais para a manipulação de vetores retrovirais e trabalhar em um laboratório de nível BSL-2 ao preparar VLPs e realizar experimentos de transdução. As nanolâminas podem ser inativadas com 70% de etanol ou 0,5% de hipoclorito de sódio. Também é aconselhável tratar todos os resíduos plásticos (pontas de pipeta, placas de cultura de tecidos, tubos de centrifugação) com hipoclorito de sódio a 0,5% por pelo menos 10 min para inativar os Nanoblades.
   2. Centrifugue o sobrenadante coletado a 500 × g por 5 min para remover os detritos celulares e recuperar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular.
      NOTA: Se os Nanoblades forem destinados a serem usados em células primárias, filtre o sobrenadante usando um filtro de 0,45 μm ou 0,8 μm. Esteja ciente de que esta etapa reduz drasticamente o título do Nanoblade, pois uma fração significativa será bloqueada na membrana do filtro.
   3. Pulverize as Nanoblades durante a noite (12-16 h) em um rotor de caçamba oscilante a 4.300 × g ou a 209.490 × g em uma ultracentrífuga por 75 min a 4 °C (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: Se as células-alvo puderem crescer em DMEM, é possível incubá-las diretamente com o sobrenadante obtido após a etapa 3.4.2 sem concentrar as nanolâminas.
5. Dia 5: Ressuspensão e armazenamento de Nanoblades
   1. Após a centrifugação, aspire lentamente o meio e ressuspenda o pellet branco com 100 μL de solução salina fria 1x tamponada com fosfato (PBS). Cobrir o tubo com parafilme e incubar durante 1 h a 4 °C com agitação suave antes de ressuspender o pellet pipetando para cima e para baixo.
      nota: Um material viscoso branco pode aparecer após a ressuspensão; Isso é normal e não afeta significativamente a eficiência da transdução.
   2. Armazene os Nanoblades a 4 °C se planeja usá-los dentro de quatro semanas. Caso contrário, congele os Nanoblades em nitrogênio líquido e armazene-os a -80 °C.
      NOTA: Use óculos de proteção e luvas criogênicas ao manipular nitrogênio líquido. O congelamento instantâneo e o armazenamento a -80 °C levam a uma diminuição significativa na eficiência do Nanoblade. Além disso, Nanoblades descongelados não devem ser congelados novamente. O protocolo pode ser pausado aqui.

4. Concentração de nanolâminas em uma almofada de sacarose

NOTA: Como alternativa à centrifugação noturna ou ultracentrifugação (etapa 3.4.3), os Nanoblades podem ser concentrados em uma almofada de sacarose. Isso produz uma fração mais pura de Nanoblades, embora a quantidade total recuperada seja menor.

1. Prepare uma solução de sacarose a 10% (peso para volume) em 1x PBS e filtre-a através de um filtro de seringa de 0,2 μm (consulte a Tabela de Materiais).
2. Comece o processo de concentração das Nanoblades na almofada de sacarose.
   1. Coloque 9 mL de amostra contendo VLP (da etapa 3.4.3) em um tubo de ultracentrífuga (consulte a Tabela de Materiais). Usando uma seringa de 3 mL e cânula, coloque lentamente 2,5 mL de sacarose a 10% sob a amostra, tentando não misturar a amostra contendo VLP e a solução de sacarose.
   2. Alternativamente, coloque 2,5 mL de sacarose a 10% em um tubo de ultracentrífuga (consulte a Tabela de Materiais). Incline o tubo e adicione lentamente os 9 mL de amostra contendo VLP (da etapa 3.4.3) com um pipetador de baixa velocidade. Durante esta operação, eleve progressivamente o tubo para a posição vertical.
3. Centrifugar as amostras a 209.490 × g em uma ultracentrífuga por 90 min a 4 °C.
   nota: Esta técnica pode ser adaptada para centrifugação de baixa velocidade (4.300 × g) durante a noite.
4. Após a centrifugação, remova o sobrenadante com cuidado e coloque o tubo de cabeça para baixo sobre papel de seda para remover qualquer líquido restante. Após 1 min, adicione 100 μL de PBS 1x e coloque o tubo a 4 °C com uma tampa de parafilme em um suporte de tubo em uma mesa de agitação por 1 h (consulte a Tabela de Materiais) antes de ressuspender o pellet pipetando para cima e para baixo.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

5. Monitorando o carregamento de Cas9 em Nanoblades por dot-blot

1. Preparar o tampão de diluição adicionando 1 volume de tampão de lise contendo um tensoactivo não iónico (ver quadro de materiais) em 4 volumes de 1x PBS. Dilua 2 μL de Nanoblades concentrados em 50 μL de tampão de diluição, vórtice brevemente, e transfira 25 μL dessa mistura para um novo tubo contendo 25 μL de tampão de diluição. Repita esta operação para ter 4 tubos de diluições Nanoblade (etapas de diluição de 2 vezes).
2. Para os controles padrão, diluir 2 μL de nuclease Cas9 recombinante (consulte a Tabela de Materiais) em 50 μL de tampão de diluição, vórtice brevemente e prosseguir para fazer oito diluições em série (diluição de 2 vezes para cada etapa).
3. Posicione cuidadosamente 2,5 μL de cada diluição de VLP e 2,5 μL de cada padrão em uma membrana de nitrocelulose com uma pipeta multicanal (um volume maior pode resultar em pontos sobrepostos).
   nota: Uma membrana de polivinildifluoreto tratada com metanol também pode ser usada.
4. Uma vez que as partículas são absorvidas pela membrana, bloqueie a membrana com 1x solução salina tamponada com Tris contendo um surfactante não iônico (TBS-T) suplementado com leite em pó desnatado (5% p/v) por 45 min em temperatura ambiente.
   nota: O protocolo pode ser pausado aqui e a membrana armazenada a 4 ° C em 1x TBS-T.
5. Descarte o 1x TBST suplementado com leite em pó desnatado e incube a membrana durante a noite a 4 ° C com o anticorpo Cas9-peroxidase de rábano (diluição de 1/1000 em 1x TBST, 5% de leite). Lave a membrana 3x com TBS-T e visualize o sinal usando um kit de substrato quimioluminescente aprimorado.
6. Quantifique a intensidade do ponto para as diluições padrão Nanoblades e Cas9 recombinantes usando o software proprietário fornecido com a estação de imagem de gel ou imageJ. Defina uma curva linear ligando a intensidade do ponto à concentração de Cas9. Utilizando a função da curva obtida, extrapolamos o teor de Cas9 em cada preparação.
   nota: A quantidade de controle de proteína Cas9 recombinante pode saturar a leitura para as amostras mais concentradas do conjunto de diluição padrão (Figura 2). Portanto, é aconselhado, ao definir a curva linear, remover a leitura das amostras não diluídas (e às vezes das primeiras etapas de diluição) se elas não estiverem na faixa linear em relação à concentração conhecida de Cas9 que foi detectada. Da mesma forma, ao extrapolar a quantidade de Cas9 nas amostras do Nanoblade, use apenas as leituras que estão dentro da faixa linear da curva padrão.

6. Transdução de células-alvo com Nanoblades (procedimento para transdução em uma placa de 12 poços)

1. Em uma placa de 12 poços, semeie 100.000-200.000 células (células aderentes primárias ou imortalizadas) por poço em 1 mL do meio de cultura celular apropriado. Permita que as células adiram à superfície da placa antes da transdução.
2. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicione 5-20 μL de Nanoblades concentrados (da etapa 3.5.1 ou 4.4) a 500 μL de meio de cultura de células e misture pipetando para cima e para baixo com um pipetador P1000. Remova o meio das células e substitua-o pelos 500 μL desta mistura Nanoblade.
   nota: A transdução deve ser otimizada para cada tipo de célula. É importante usar o menor volume possível de meio (evitando o ressecamento das células-alvo) para que os Nanoblades permaneçam altamente concentrados. As células aderentes devem ser transduzidas diretamente enquanto estiverem conectadas à placa (não transduza em suspensão, pois isso diminuirá significativamente a eficiência da transdução). Algumas células toleram a exposição prolongada a Nanoblades (24-48 h), enquanto outras são muito sensíveis e podem formar pequenos sincícios. Nesse caso, os Nanoblades devem ser incubados com células apenas por 4-6 h antes de substituir o meio. A escultura também pode melhorar a transdução para células cultivadas em suspensão. Adjuvantes como polímeros catiônicos (consulte a Tabela de Materiais) também podem melhorar a eficiência da transdução em alguns tipos de células.
3. Após 4-6 h de incubação celular em um baixo volume de meio contendo Nanoblades, aumente o volume do meio para a quantidade normal (1 mL se estiver trabalhando com uma placa de 12 poços) ou substitua-o por meio fresco se as células forem sensíveis a VLPs.
   nota: O meio celular contendo Nanoblades deve ser inativado com hipoclorito de sódio a 0,5% por 10 minutos antes de descartá-lo. Use luvas e óculos de proteção ao manipular o hipoclorito de sódio. Se as nanolâminas induzirem a morte celular, adapte a quantidade e o tempo total de exposição para reduzir a mortalidade celular.

Resultados

Figura 1: Morfologia das células produtoras durante a produção de Nanoblade.(A) HEK293T células a 70-80% de confluência 24 h após o plaqueamento. (B e C) HEK293T morfologia celular 24 h após a transfecção. (D) HEK293T morfologia celular 40 h após a transfecção. Barras de escala = 400 μm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
13,2 mL, Tubos de polipropileno de parede fina, 14 x 89 mm - 50Pk	Ciências da Vida Beckman Coulter	331372	Tubos de ultracentrifugação para purificação de nanolâminas
Membranas de Western blotting Amersham Protran Premium, nitrocelulose	Merck	GE10600004	Membrana de nitrocelulose para quantificar os níveis de Cas9 em nanoblades purificados
BIC-Gag-CAS9	Addgene	119942	Codifica uma fusão GAG (F-MLV)-CAS9(sp). Permite a produção de partículas semelhantes ao vírus GAG-CAS9 a partir de células produtoras em associação com gRNA(s) superexpresso(s) e envelopes apropriados
BICstim-Gag-dCAS9-VPR	Addgene	120922	Codifica uma fusão GAG-dCAS9-VPR para ativação transcricional direcionada
lâmina	Addgene	134912	Backbone vazio para clonagem da sequência de sgRNA a ser usada no sistema Nanoblades
BsmBI-v2	Biolabs da Nova Inglaterra	R0739S	Enzima de restrição para digerir os vetores BLADE e SUPERBLADES para clonagem de sgRNA
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (conjugado HRP) #97982	Tecnologia de sinalização celular	97982S	Anticorpo anti-Cas9 para quantificação de Cas9 por dot-blot
Cas9 Nuclease, S. pyogenes	Biolabs da Nova Inglaterra	M0386T	Proteína Cas9 recombinante a ser usada como referência para quantificação absoluta da quantidade de Cas9 carregada em Nanoblades
Solução de brometo de etídio (10 mg/ml em H2O)	Sigma-Aldrich	E1510-10ML	Para corar géis de agarose e visualizar DNA
Agitadores de movimento de onda Fisherbrand	Fisher Científico	88-861-028	Mesa de agitação para ressuspender Nanoblades após centrifugação
gelAnalyzer			http://www.gelanalyzer.com; quantificar a intensidade da banda após a digestão
Produtor de Gesícula 293T	Takara	632617	Linha celular produtora de nanoblades
Gibco DMEM, glicose alta, piruvato	ThermoFisher Scientific	41966052	Meio de cultura celular para células Gesicle Producer 293T
Kit de reagentes de transfecção jetPRIME para DNA e DNA/siRNA	Poliplus	POL114-15	Reagente de transfecção para produção de nanolâminas em células Gesicle Producer 293T
Millex-AA, 0,80 μm, filtro de seringa	Millipore	SLAA033SS	Filtro de seringa para remover detritos celulares antes da concentração de Nanoblades
Millex-GS, 0,22 μm, filtro de seringa	Millipore	SLGS033SS	Filtro de seringa para esterilizar a solução de almofada de sacarose
Millex-HP, 0,45 μm, polietersulfona, filtro de seringa	Millipore	SLHP033RS	Filtro de seringa para remover detritos celulares antes da concentração de Nanoblades
Kit de extração de gel de DNA monarca	Biolabs da Nova Inglaterra	T1020L	Kit de extração de gel de DNA para purificação do fragmento de plasmídeo pBLADES ou pSUPERBLADES após digestão com BsmBI
E. coli competente estável NEB (alta eficiência)	Biolabs da Nova Inglaterra	C3040I	Bactérias competentes para transformação e amplificação de plasmídeos
Kit NucleoBond Xtra Midi para DNA de plasmídeo de grau de transfecção	Macherey-Nagel	Rolamento 740410.5	Kit de maxipreparação para purificação de DNA plasmidial de bactérias cultivadas
Kit de extração de gDNA de nucleospin	Macherey-Nagel	Rolamento 740952.5	Extração de DNA genômico de células transduzidas
NucleoSpin Plasmid, Mini kit para DNA de plasmídeo	Macherey-Nagel	Rolamento 740588.5	Minikit de preparação para purificação de DNA plasmidial de bactérias cultivadas
NucleoSpin Tissue, Mini kit para DNA de células e tecidos	Macherey-Nagel	Rolamento 740952.5	Kit de extração de DNA genômico
Optima XE-90	Ciências da Vida Beckman Coulter	A94471	Ultracentrífuga
pBaEVRless	Els Verhoeyen (Inserm U1111)	Pedidos pessoais devem ser enviados para: els.verhoyen@ens-lyon.fr	Retrovírus endógeno de babuíno A glicoproteína Rless descrita em Girard-Gagnepain, A. et al. Os LVs pseudotipados do envelope de babuíno superam os VSV-G-LVs na transferência de genes para HSCs estimulados por citocinas precoces e em repouso. Sangue 124, 1221–1231 (2014)
pBS-CMV-gagpol	Addgene	Rolamento 35614	Enumera os genes gag e pol do vírus da leucemia murina
pCMV-VSV-G	Addgene	Nº 8454	Proteína do envelope para produção de partículas retrovirais lentivirais e MuLV
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientific	14200091	10X PBS para diluir em água milipore
Reagente de transfecção de polibreno	Millipore Sigma	TR-1003-G	Polímero catiônico que aumenta a eficiência da transdução retroviral em células específicas de mamíferos. Também pode permitir a entrada dependente de um oligodesoxinucleotídeo (ODN) para reparo dirigido por homologia
Sacarose, para biologia molecular, ≥99,5% (GC)	Sigma-Aldrich	S0389-5KG	Sacarose para preparar uma almofada para purificação de nanolâminas por ultracentrifugação
SUPERBLADE5	Addgene	134913	Backbone vazio para clonagem de sequência de sgRNA a ser usado no sistema de nanoblades (otimizado para maior eficiência de edição do genoma via Chen B et al., 2013)
Substrato de Duração Prolongada SuperSignal West Dura	ThermoFisher Scientific	Rolamento 34076	Substrato HRP de quimioluminescência aprimorada (ECL) para borrões de pontos Cas9
SW 41 Ti Rotor de caçamba oscilante	Ciências da Vida Beckman Coulter	331362	Rotor para ultracentrifugação
SYBR Safe DNA Gel Mancha	ThermoFisher Scientific	S33102	Alternativa ao brometo de etídio para coloração de géis de agarose e visualização de DNA
DNA ligase T4	Biolabs da Nova Inglaterra	M0202S	DNA ligase para ligar os vetores BLADE ou SUPERBLADES com os oligos de DNA duplex correspondentes à região variável do sgRNA
Tampão de lise contendo Triton	Promega	E291A	Tampão de lise para interromper Nanoblades e permitir quantificação de Cas9
DOIS ANOS 20	Sigma-Aldrich	Pág. 9416	Para a preparação do TBST