Microinjeção de embrião de mosquito: uma técnica para entregar DNA exógeno na gema embrionária de Anopheles gambiae para gerar mutações germinativas

Resumo

Fonte: Carballar-Lejarazú, R. et al, Método de microinjeção para embriões de Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (2021).

Neste vídeo, demonstramos a entrega da construção do gene drive no embrião do mosquito Anopheles gambiae por meio da técnica de microinjeção de embriões. Este procedimento permite a integração da construção de DNA entregue, por meio de recombinação homóloga, nas células germinativas para gerar uma população de mosquitos transformada.

Protocolo

1. Microinjeção de embriões

1. Use uma ponta de micro-carregador para encher as agulhas com 2 μL de mistura de DNA (DNA de plasmídeo a uma concentração de 300-400 ng/μL. Insira a agulha no porta-agulha e conecte o tubo da bomba de pressão automatizada (Figura 1).
2. Importante: Alinhe a agulha de forma que ela faça um ângulo de 15° com o plano da lâmina (Figura 1).
3. Abra a ponta da agulha tocando cuidadosamente no primeiro ovo do mosquito Anopheles gambiae e injete-o inserindo a ponta da agulha ≤ 10 μm no pólo posterior. Uma injeção bem-sucedida levará a um pequeno movimento do citoplasma dentro do óvulo.
4. Use os controles de estágio coaxial do microscópio para passar para o próximo ovo para continuar a injeção.
   1. Para garantir que a ponta da agulha permaneça aberta e não entupida, pressione o botão Injetar antes de entrar em outro embrião e visualize a pequena gota na abertura da agulha.
   2. Se a agulha ficar entupida, pressione o botão Limpar para limpar a agulha e repita o teste de visualização de gotículas. Ajuste a pressão conforme necessário se a abertura da ponta da agulha ficar um pouco maior para garantir que o tamanho da gota permaneça pequeno.
   3. Injete ~ 40-50 ovos com uma agulha.
      nota: Certifique-se de que o papel de filtro permaneça úmido o tempo todo. Mantenha contrapressão suficiente na agulha para mantê-la limpa. Uma agulha que não pode ser desobstruída deve ser substituída por uma agulha nova. A colocação do embrião, a inserção da agulha e a injeção são facilitadas com microscópios que possuem controles coaxiais para o movimento horizontal da platina (Figura 2).
5. Após a conclusão das injeções, enxágue os ovos em um recipiente de vidro forrado com papel de filtro e preenchido com 50 mL de H2O deionizado (Figura 3).
   nota: Os embriões começarão a eclodir 2 dias após a injeção e podem levar de 3 a 5 dias. As larvas de primeiro ínstar eclodidas devem ser transferidas imediatamente (verificar 2 vezes ao dia) para um recipiente limpo com água e comida.

Resultados

Figura 1: Posição da agulha durante as microinjeções. A) Vista grande angular da fase de injeção. B,C) Posicione a agulha de modo que os embriões alinhados formem um ângulo de 15° com a agulha de injeção. Não eleve o braço do instrumento de microinjeção que segura a agulha significativamente mais alto do que o microscópio para garantir a angulação adequada entre a agulha e a lâmina c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10x tampão de microinjeção	-	-	Tampão NaHPO4 de 1 mM, pH 6,8, KCl de 50 mM
Membrana de blotting (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)	Bio-Rad		Ordenada e retamente cortada em um pedaço de 2x1 cm
Água desionizada ou bidestilada (ddH20)	Mili-Q		Em uma garrafa de lavagem
Microscópio de dissecação	Leica	Leica MZ12	Para alinhamento embrionário
Recipiente de vidro	Pyrex	Nº 3140	125 x 65
Corrediça de vidro	Marca Fisher	Nº 12-549-3	75x26 milímetro
Microinjetor	Instrumento Sutter		Microinjetor digital XenoWorks
Pontas de pipeta de microcarregador	Eppendorf		Microcarregador de 20 μL epT.I.P.S.
Micromanipulador	Instrumento Sutter		Micromanipulador XenoWorks
Micropipeta	Rainin		20 μL
microscópio	Leica	DM 1000 LED ou M165 FC	Para microinjeção
Malha de nylon
Pincel	Blick	Nº 05831-7040	Fino, tamanho 4/0
Placa de Petri			Plástico, (60x15 mm, 90x15 mm)