Entrega de genes hidrodinâmicos: uma técnica para transfecção in vivo de DNA exógeno em hepatócitos murinos via injeção de veia da cauda

Resumo

Fonte: Hübner, E. K. et al., Sistemas Constitutivos e Induzíveis para Modificação Genética In Vivo de Hepatócitos de Camundongos Usando Injeção Hidrodinâmica da Veia da Cauda. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve a técnica de transfecção genética in vivo de hepatócitos murinos por injeção hidrodinâmica da veia da cauda. Este sistema de transfecção gera uma expressão de longo prazo do transgene nos hepatócitos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparando a solução para injeção hidrodinâmica da veia da cauda

NOTA: Preparar as construções plasmidiais para a expressão gênica constitutiva e induzível por meio da técnica de clonagem usando bactérias competentes.

1. Prepare soro fisiológico estéril a 0,9% para injeção (não use PBS). Use o volume correspondente a cerca de 10% do peso corporal do camundongo. Exemplo: para um camundongo pesando 20 g, prepare 2 mL de solução.
2. Prepare vetores de injeção que foram purificados usando um kit de purificação de plasmídeo livre de endotoxinas.
3. Adicione 10 μg ou 15 μg de construção de vetor de beleza adormecida livre de endotoxinas (use 10 μg, da etapa 4 use 15 μg, respectivamente) e 1 μg de pc-HSB5 livre de endotoxinas por mL de solução salina estéril.
4. Conservar a solução até 4 h a 4 °C. Não congele.

2. Realizando injeção hidrodinâmica na veia da cauda

1. Use um limitador para injeção da veia da cauda (comercial ou preparado a partir de um tubo cônico de 50 mL com orifícios para respiração e para a cauda). Encha o fundo do tubo com papel de seda.
2. Para injeção, use camundongos com cerca de 8 a 10 semanas de idade com pesos de 20 a 25 g.
3. Pesar os ratinhos antes da injeção e preparar o volume de injeção de acordo com o peso corporal (correspondente a 10% do peso corporal). Prepare uma seringa estéril de 3 ml com uma agulha de 27 G para injeção e encha com o volume necessário.
4. Coloque o mouse na restrição. Ajuste a quantidade de papel de seda para deixar apenas espaço mínimo para movimento, mas espaço suficiente para respirar.
5. Certifique-se de que o mouse esteja respirando regularmente.
6. Aqueça a cauda usando uma lâmpada infravermelha por 30-60s. Observe cuidadosamente os sinais de superaquecimento.
7. Limpe a cauda com um cotonete embebido em álcool.
8. Insira a agulha quase horizontalmente em uma das duas veias laterais da cauda próximas à base da cauda.
   nota: Se colocado com sucesso, uma pequena quantidade de sangue pode fluir de volta para o cone da agulha. Não é recomendado aspirar ativamente, pois qualquer movimento adicional da agulha pode resultar em seu deslocamento e/ou lesão da veia.
9. Injete o volume total na veia da cauda dentro de 8 a 10 s.
10. Remova imediatamente o mouse do retentor. Comprima a ferida injetável por pelo menos 30 s ou até que o sangramento desapareça.
11. Coloque o mouse em uma gaiola separada. Assim que o mouse se recuperar do procedimento (cerca de 30 a 60 minutos), transfira-o de volta para sua gaiola original. Verifique o mouse regularmente para os próximos 24 h.
    nota: A sedação leve do camundongo é rotineiramente observada por até 2 h após a injeção.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NaCl 0,9%	Braun	3200905	Transportador para injeções intravenosas
Tubo Cônico Falcon 50ml	Corning Ciências da Vida	352095
Lâmpada infravermelha	N/A	N/A	Para o aquecimento da cauda do rato
Plasmídeos para clonagem de vetores de transposon da bela adormecida para HTVI.
pTC	n/a		Vetor para expressão gênica constitutiva
pEN_TTmcs	Addgene	#25755	Vetor de entrada para expressão gênica induzível
pEN_TTGmiRc2	Addgene	#25753	Vetor de entrada para expressão de miRshRNA induzível com coexpressão de GFP
pEN_TTmiRc2	Addgene	#25752	Vetor de entrada para expressão de miRshRNA induzível sem coexpressão de GFP
pTC ApoE-Tet	Addgene	#85578	Vetor de expressão para expressão de gene induzível ou miR-shRNA com promotor ApoE.HCR.hAAT
pTC-CMV-Tet	Addgene	#85577	Vetor de expressão para expressão de gene induzível ou miR-shRNA com promotor de CMV