Transformação genética mediada por agrobactérias: um método para transformar geneticamente o genoma do arroz por meio de Agrobacterium tumefaciens geneticamente modificado

Resumo

Fonte: Xu, D., et al. Transformação genética mediada por agrobactérias, produção transgênica e sua aplicação para o estudo do desenvolvimento reprodutivo masculino em arroz. J. Vis. Exp. (2020).

Neste vídeo, demonstramos a transformação genética do genoma do arroz usando um vetor binário de Agrobacterium tumefaciens. Esta bactéria facilita a transferência de um plasmídeo de DNA estranho usando proteínas de virulência de Agrobacterium.

Protocolo

1. Transformação genética de arroz e cultura de tecidos vegetais

1. Indução e regeneração de calos
   nota: Use inflorescências frescas de arroz jovem como material de partida para induzir calos (Figura 1).
   1. Colete as inflorescências jovens do arrozal ou estufa no estágio de meiose, determinado pelo comprimento da florzinha de 1,6-4,8 mm (Figura 1A). Certifique-se de que as inflorescências do arroz estejam cobertas com bainha de folhas. Limpe cada inflorescência com um cotonete com álcool 70% e deixe secar antes de cortar.
   2. Leve a inflorescência para uma bancada limpa e estéril. Corte em pedaços pequenos (quanto menor, melhor) com uma tesoura esterilizada e, em seguida, transfira as estacas para uma placa de Petri contendo meio NBD2 (Figura 1B, Tabela 1).
   3. Incubar a placa no escuro a 26 °C por cerca de 10-14 dias para induzir calos (Figura 2A).
      nota: Use o calo recém-formado para infiltração de Agrobacterium (etapa 1.2.7) diretamente ou recondicione mais uma vez em meio NBD2 fresco para obter mais calos. Transfira o calo para o novo meio NBD2 a cada 8 a 10 dias.
2. Transformação e co-cultivo
   1. Use a bactéria A. tumefaciens contendo o plasmídeo binário com a construção sgRNA-CAS9 para transformação. Armazene as cepas de A. tumefaciens em meio YEB (Tabela 1) com glicerol a 50% a -80 ° C para uso posterior.
   2. Listre A. tumefaciens de um estoque de glicerol de -80 ° C para meio de ágar YEB contendo antibióticos seletivos (Tabela 1) e cresça a 25-28 ° C por 48-72 h, para permitir o aparecimento de colônias.
   3. Inocular uma única colônia da placa YEB com antibióticos seletivos para 5 mL de meio YEB líquido contendo os mesmos antibióticos seletivos (Tabela 1), em um tubo de ensaio estéril cônico de 50 mL. Agitar num agitador orbital a 250 x g, a 25-28 °C até que as bactérias cresçam até uma DO₆₀₀ de 0,5.
   4. Adicionar 1 ml de suspensão bacteriana a 100 ml de meio YEB (Tabela 1) com os mesmos antibióticos selectivos num balão cónico de 250 ml e agitar num agitador orbital a 250 x g, a 28 °C durante 4 h.
   5. Centrifugue a 4.000 x g por 10 min em temperatura ambiente para coletar bactérias. Descarte o sobrenadante.
   6. Ressuspender o sedimento bacteriano com meio AAM-AS (quadro 1) e diluir a suspensão até uma DO₆₀₀ = 0,4.
      nota: O OD perfeito da suspensão bacteriana é fundamental para uma transformação eficiente. Ajuda a eliminar o excesso de crescimento bacteriano no calo.
   7. Recolha cerca de 150 calos embriogénicos frágeis amarelo-claros de crescimento saudável do passo 1.1.3 para um balão estéril de 150 ml. Adicione 50 a 75 mL de suspensão de células bacterianas da etapa 1.2.6 no frasco estéril e, em seguida, adicione um pouco de 10 a 25 mL de meio AAM-AS fresco para mergulhar o calo por 10 a 20 minutos, agitando ocasionalmente.
   8. Despeje a suspensão bacteriana do frasco com cuidado e seque o excesso de suspensão bacteriana do calo usando papel de filtro estéril # 1 ou papel de seda. Em seguida, coloque-os em uma placa de Petri com meio NBD-AS (Tabela 1) coberto com um papel de filtro estéril # 1. Incube a 25–28 °C no escuro por 3 dias e verifique se há supercrescimento bacteriano.
3. Seleção para calos resistentes
   1. Após 3 dias de co-cultivo, transfira os calos para uma placa de Petri estéril com um papel de filtro estéril.
   2. Seque o calo ao ar por 2 h em uma bancada limpa. Certifique-se de que o calo não esteja aderido ao papel de filtro.
   3. Transferir os calos uniformemente com uma pinça estéril para o meio de seleção primário NBD2 (com 40 mg/L de higromicina e 250 mg/L de timentina) (Tabela 1). Calos de cultura por 2 semanas a 25–28 °C no escuro.
   4. Após 2 semanas, transfira os calos uniformemente para uma nova placa contendo o meio de seleção fresco NBD2 (com 40 mg / L de higromicina e 250 mg / L de timentina) (Tabela 1). Cultive o calo por mais 2 semanas a 25–28 °C no escuro.
4. Diferenciação de calos
   1. Transfira o calo para o meio MS fresco (com 25 mg / L de higromicina e 150 mg / L de timentina) (Tabela 1). Cultura sob luz a 25–28 °C por cerca de 2 semanas.
   2. Repita a etapa 1.4.1 mais uma vez.
   3. Transfira os brotos para o novo meio MS (com 10 mg/L de higromicina) para proliferar mais brotos.

Tabela 1: Composições de mídia para transformação de arroz. Clique aqui para baixar esta tabela.

Resultados

Figura 1: Materiais de partida para induzir calos. (A) Inflorescências de arroz jovens no estágio de meiose. (B) Inflorescências jovens dissecadas crescendo no meio NBD2. Barra = 2 cm em (A).

Figura 2: Procedimento para produção de linhagens transgênic...