1. Eletroporação para superexpressão do transgene do receptor Hh: pEGFP-Smo
- Para eletroporação usando uma cubeta de intervalo de 2 mm, prepare a seguinte mistura de eletroporação de células de plasmídeo para cada reação de eletroporação: 1,2 × 106 células precursoras de células granulares cerebelares primárias de camundongo e 10 μg de pEGFP-mSmo (ajuste a concentração de estoque de DNA para ~ 2-5 μg / μL em tampão Tris-EDTA ou dHestéril 2O) em 100 μL de Opti-MEM.
nota: Reduza o número total de células se as células forem insuficientes (embora isso possa reduzir a eficiência da eletroporação). No entanto, não ajustar a quantidade de plasmídeo nem o volume total de Opti-MEM utilizado por cubeta. Se o número total de células necessário para o experimento exceder 1,5 × 106 células, aumente a mistura de eletroporação de acordo e execute várias reações de eletroporação separadamente. A cubeta pode ser reutilizada até 5 vezes.
- Preparar a placa de semeadura de células pós-electroporação adicionando 0,5 ml de meio de cultura em cada alvéolo da placa de cultura de 24 poços contendo lamínulas revestidas e mantê-la quente a 37 °C numa incubadora de CO2. Para preparar as lamínulas para fixação das células, incubar lamínulas de vidro autoclavadas de 12 mm com 100 μg/ml de poli-D-lisina (PDL, 1 mg/ml em dHestéril 2O) durante pelo menos 1 h a 37 °C. Manter as lamínulas na mesma solução de PDL a 4 °C até à utilização.
- Pipetar o número necessário de células para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml e centrifugar a 200 × g durante 5 min a RT. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 200 μL de Opti-MEM. Repita esta etapa duas vezes com Opti-MEM para garantir que nenhum meio de cultura residual esteja presente no tubo.
nota: Para cada poço/lamínula de uma placa de 24 poços, eletroporado e semeado 1,2-1,3 × 106 células/poço para obter ~70-75% de confluência celular no dia seguinte de cultura.
- Defina os parâmetros de eletroporação conforme mostrado na Tabela 1.
- Pipetar suavemente a reação de electroporação para misturar bem e utilizar uma ponta longa P200 para transferir um volume exacto de 100 μL da mistura para a cubeta com intervalo de 2 mm. Evite formar bolhas.
- Coloque a cubeta na câmara da cubeta.
- Pressione o botão Ω do eletroporador (consulte a Tabela de Materiais) e anote o valor da impedância, que deve ser ~30-35. Para garantir que o valor da impedância elétrica Ω na faixa de 30-35, respeite um volume preciso de 100 μL.
- Pressione o botão Iniciar para iniciar o pulso.
- Registre os valores da corrente medida e joules mostrados no quadro de leitura.
- Remova a cubeta da câmara da cubeta.
- Adicione imediatamente 100 μL de meio de cultura pré-aquecido na cubeta e ressuspenda-o pipetando suavemente para cima e para baixo 2-3 vezes. Transfira imediatamente a suspensão da célula para a placa de 24 poços contendo lamínulas revestidas preparadas na etapa 1.2.
nota: Para minimizar a morte celular, semeie as células imediatamente após a eletroporação.
- Incubar as células a 37 °C numa incubadora de CO2. Deixe as células intactas por 3 h para evitar o descolamento celular.
- Às 3 h após a semeadura, aspire suavemente e descarte metade do meio sobrenadante para remover células mortas flutuantes e detritos e substitua pela mesma quantidade de meio de cultura pré-aquecido.
- Incubar as células a 37 °C na incubadora de CO2.
| Configuração de pulso de poring | Configuração de pulso de transferência |
| GCPs primários do mouse | Neurônios primários | GCPs primários do mouse | Neurônios primários |
| voltagem | 275 V | 275 V | 20 V | 20 V |
| comprimento | 1 ms | 0,5 ms | 50 ms | 50 ms |
| intervalo | 50 ms | 50 ms | 50 ms | 50 ms |
| Não. | algarismo | algarismo | 5 | 5 |
| Taxa D | 10% de sucesso | 10% de sucesso | 40% de sucesso | 40% de sucesso |
| polaridade | + | + | ± | ± |
Tabela 1: Os parâmetros de eletroporação de GCPs primários de camundongos e neurônios primários usando o Super Electroporator NEPA21 TYPE
