Nucleofecção de formas de parasitas: um método de transfecção baseado em eletroporação para entregar plasmídeos codificadores de proteínas fluorescentes no núcleo do esporozoíto

Resumo

Fonte: Duan, C., et al. Nucleofecção e Propagação In Vivo de Parasitas Eimeria de Galinha. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, descrevemos a nucleofecção, um procedimento de transfecção baseado em eletroporação para fornecer DNA de plasmídeo codificador de proteína repórter fluorescente na forma de esporozoíto do parasita Eimeria de galinha.

Protocolo

1. Nucleofecção de merozoítos ou esporozoítos

1. Preparação antes da nucleofecção de parasitas
   1. Prepare cerca de 10⁷ merozoítos ou esporozoítos em um tubo. Se transfectar merozoítos, prepare 3-4 tubos.
   2. Preparar uma quantidade de ADN plasmidial ou fragmento de PCR purificado igual ou superior a 10 μg.
      nota: O plasmídeo utilizado neste estudo contém 2 genes: proteína fluorescente amarela aprimorada (EYFP) e diidrofolato redutase timidilato sintase derivada de Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS).
   3. Preparar 25 U de enzima de restrição. Se os plasmídeos forem linearizados, a enzima de restrição pode melhorar a eficiência da transfecção. Se os plasmídeos forem circulares, omita a enzima de restrição.
   4. Prepare 85 μL de tampão de nucleofecção (Tabela 1): misture 20 μL de tampão de nucleofecção I e 1 mL de tampão de nucleofecção II e use uma parte da solução. O volume do tampão total é de 100 μL.
2. Nucleofecção
   1. Centrifugue a suspensão de esporozoíto ou merozoíto a 600 x g por 10 min. Em seguida, descarte o sobrenadante.
   2. Na ordem a seguir, adicione 85 μL de tampão de transfecção nuclear, 10 μg de plasmídeo (fragmento de PCR) e 25 U de enzima de restrição (geralmente 5 μL) no tubo de 1,5 mL contendo esporozoítos ou merozoítos.
   3. Transfira a suspensão para um copo de transfecção nuclear. Coloque o copo em uma ranhura de transferência nuclear.
   4. Ligue o dispositivo de nucleofecção usando o botão liga/desliga e selecione o procedimento de transfecção U-033. Se o dispositivo de nucleofecção iniciar no modo Free Program Choice, saia deste modo pressionando o botão X.
   5. Quando o programa terminar, pressione o botão X do dispositivo de nucleofecção e a tela exibirá OK, indicando que a nucleofecção foi bem-sucedida.
   6. Adicione 0,5-1 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) ao copo de nucleofecção para interromper a reação e transfira a suspensão para um tubo de 1,5 mL após misturar suavemente.

buffer	composição
Tampão de nucleofecção I	ATP-dissódico 2g, MgCl 2-6H2O 1,2g, 10 ml de água
Tampão de nucleofecção II	KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, glicose 0,2 g, 500 ml de água
*Água: Água destilada

Tabela 1: Composição dos Buffers.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	MACGENE	CM15019
Dispositivo de nucleofecção	LONZA/amaxa	90900012 (Nucleofector II)
glicose	sigma	Nº V900116
ATP-dissódico	sigma	Rolamento A26209
Celulose DE-52	Solarbio	C8350
KH2PO4	sigma	Nº V900041
Centrífuga de baixa velocidade	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.	DT5-2
MgCl2	sigma	449164
NaHCO3	sigma	144-55-8
Pbs	Solarbio	Pág. 1010
Microcentrífuga Sorvall Legend Micro 17	ThermoFisher Scientific	75002430
tripsina	Solarbio	T8150
Percoll (solução de reserva-mãe de gradiente DG)	GE Saúde	17-0891-09