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1. Nucleofecção de merozoítos ou esporozoítos
- Preparação antes da nucleofecção de parasitas
- Prepare cerca de 107 merozoítos ou esporozoítos em um tubo. Se transfectar merozoítos, prepare 3-4 tubos.
- Preparar uma quantidade de ADN plasmidial ou fragmento de PCR purificado igual ou superior a 10 μg.
nota: O plasmídeo utilizado neste estudo contém 2 genes: proteína fluorescente amarela aprimorada (EYFP) e diidrofolato redutase timidilato sintase derivada de Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS).
- Preparar 25 U de enzima de restrição. Se os plasmídeos forem linearizados, a enzima de restrição pode melhorar a eficiência da transfecção. Se os plasmídeos forem circulares, omita a enzima de restrição.
- Prepare 85 μL de tampão de nucleofecção (Tabela 1): misture 20 μL de tampão de nucleofecção I e 1 mL de tampão de nucleofecção II e use uma parte da solução. O volume do tampão total é de 100 μL.
- Nucleofecção
- Centrifugue a suspensão de esporozoíto ou merozoíto a 600 x g por 10 min. Em seguida, descarte o sobrenadante.
- Na ordem a seguir, adicione 85 μL de tampão de transfecção nuclear, 10 μg de plasmídeo (fragmento de PCR) e 25 U de enzima de restrição (geralmente 5 μL) no tubo de 1,5 mL contendo esporozoítos ou merozoítos.
- Transfira a suspensão para um copo de transfecção nuclear. Coloque o copo em uma ranhura de transferência nuclear.
- Ligue o dispositivo de nucleofecção usando o botão liga/desliga e selecione o procedimento de transfecção U-033. Se o dispositivo de nucleofecção iniciar no modo Free Program Choice, saia deste modo pressionando o botão X.
- Quando o programa terminar, pressione o botão X do dispositivo de nucleofecção e a tela exibirá OK, indicando que a nucleofecção foi bem-sucedida.
- Adicione 0,5-1 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) ao copo de nucleofecção para interromper a reação e transfira a suspensão para um tubo de 1,5 mL após misturar suavemente.
| buffer
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composição
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| Tampão de nucleofecção I | ATP-dissódico 2g, MgCl 2-6H2O 1,2g, 10 ml de água |
| Tampão de nucleofecção II | KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, glicose 0,2 g, 500 ml de água |
| *Água: Água destilada | |
Tabela 1: Composição dos Buffers.