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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Remova as células do cumulus dos óvulos fertilizados.
- Sob um estereomicroscópio, use 2 seringas de insulina: a primeira para segurar o oviduto e a segunda para rasgar a ampola e dispersar os óvulos fertilizados na solução de trabalho da hialuronidase.
- Pegue a pipeta de vidro preparada para coletar ovos e conecte-a ao tubo e a um filtro de 0,22 μm montado no bocal para aspirar todos os ovos. Recolher todos os ovos e lavá-los por passagem sucessiva em 6 gotas diferentes de 100 μL de meio M2.
- Coloque os ovos fertilizados lavados em incubadora umidificada a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO2 em meio M16.
2. Fazendo pipetas de injeção
- Use tubos capilares de vidro de paredes finas (10-15 cm de comprimento) com um diâmetro externo de 1 mm e prenda este capilar em um extrator de micropipeta horizontal.
nota: Na maioria dos extratores de pipetas horizontais, 3 parâmetros podem ser ajustados: potência térmica, força de tração e atraso de tempo entre o aquecimento e a tração. Ajuste esses parâmetros para obter pipetas injetoras semelhantes às apresentadas na Figura 1A. Para usuários que realizam microinjeção de DNA rotineiramente, use as configurações padrão e ajuste o atraso entre o aquecimento e a tração para alterar a forma global da ponta da pipeta.
3. Fazendo pipetas de retenção
- Use uma pipeta injetora para preparar a pipeta de retenção.
- Conecte uma pipeta injetora a uma microforja. Corte a pipeta com a microforja para obter uma ponta simétrica afiada de 80 a 100 μm de diâmetro. Em seguida, polir a ponta com calor na microforja para obter uma forma redonda simétrica sem sebes afiadas.
4. Preparação da pipeta de injecção contendo o vector lentiviral
- Centrifugue a suspensão do vetor lentiviral a 160 x g por 2 min para pellet detritos frequentemente presentes em estoques lentivirais congelados.
- Recupere o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo de 0,5 ml numa cabina de segurança de classe II.
- Transfira 1 μL de sobrenadante para uma pipeta de injeção preparada conforme descrito na etapa 5 usando um microcarregador.
- Coloque a pipeta de injeção no suporte do instrumento do micromanipulador direito. Conecte a pipeta de retenção ao micromanipulador esquerdo.
nota: O título de transdução do vetor lentiviral será diretamente correlacionado com a eficácia da produção de fundadores. Para alta eficácia (>70%), use vetores virais com um título na faixa de 100 ng de proteína do capsídeo p24 / μL. Quando o título é expresso em unidades de transdução (TU), o título deve ser superior a 109 TU/mL. Os estoques de vetores lentivirais devem ser produzidos por transfecção transitória de células 293T com o plasmídeo de encapsídeo p8.91, pHCMV-G, que codifica a glicoproteína-G do vírus da estomatite vesicular (VSV), conforme descrito em métodos suplementares.
5. Microinjeção
- Dispense 8 μL de meio M2 no centro de uma lâmina de depressão e cubra com óleo de parafina leve (embrião testado) para evitar a evaporação.
- Coloque 20 ovos na gota o menos dispersa possível.
cuidado: Não faça bolhas ao depositar os embriões.
- Certifique-se de que a ponta da pipeta de injeção esteja aberta. Caso contrário, bata na pipeta de injeção com a pipeta de retenção.
- Defina o microinjetor para um tempo de injeção de 20 s.
nota: A viscosidade da suspensão viral permite a visualização clara da dispersão do vetor viral no espaço perivitelino. A pressão de injeção deve ser ajustada para preencher todo o espaço dentro de 20 s após a injeção, o que representa um volume de 10 a 100 pL. A pressão de injeção não deve exceder 600 hPa.
- Aspire um óvulo fertilizado que contenha 2 pronúcleos e 2 corpos polares com a pipeta de retenção sob o estereomicroscópio.
- Injetar o óvulo com o microinjetor no espaço perivitelino.
cuidado: Não toque na membrana plasmática com a pipeta de injeção.
- Injete todos os óvulos fertilizados disponíveis em lotes de 20 ovos e coloque os ovos injetados imediatamente em meio M16 pré-aquecido na incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2.
nota: Incubar os óvulos injetados durante um mínimo de 30 minutos após a injeção, antes da transferência dos embriões.
