Entrega de genes lentivirais assistida por laser: uma técnica para permeabilizar óvulos fertilizados com camundongos para facilitar a entrega de genes lentivirais

Resumo

Fonte: Martin, N. P., et al. Entrega de genes lentivirais assistida por laser para óvulos fertilizados com camundongos. J. Vis. Exp. (2018).

Neste vídeo, demonstramos a permeação assistida por laser da camada protetora da zona pelúcida em óvulos fertilizados com camundongos para facilitar a entrega do gene lentiviral. O lentivírus permite a geração de animais transgênicos com um gene de interesse integrado de forma estável em seu genoma.

Protocolo

1. Perfuração de óvulos fertilizados com camundongos com laser XYClone

1. Configure e calibre o laser XYClone de acordo com a recomendação do fabricante. Outros lasers, normalmente usados para fertilização in vitro, podem ser substituídos pelo laser XYClone para perfurar óvulos fertilizados.
   1. Conecte o fio da caixa do controlador de laser ao aparelho de laser no microscópio.
   2. Conecte a caixa do controlador do laser ao computador que executa o software do laser por meio de uma porta USB. 3.1.3. Conecte o controlador do laser e ligue-o.
   3. Olhando através da ocular, perfure uma amostra de teste (por exemplo, marcações de apagamento a seco em uma lâmina de vidro).
   4. Use uma pequena chave de fenda (incluída no kit de laser) para ajustar a posição X e Y do laser para corresponder à luz LED visível através da ocular do microscópio e calibre o laser.
2. Coloque uma placa de queda KSOM contendo ovos fertilizados com camundongos no microscópio stage. Não mantenha a placa fora da incubadora por mais de 15 min.
3. Olhe através da ocular do microscópio e certifique-se de que a zona pelúcida do embrião esteja em foco e a luz LED do laser esteja visível.
4. Mova o microscópio stage para atingir a zona com a luz LED/laser.
5. Usando o software de computador, defina o laser XYClone para 250 μs.
6. Ajuste o tamanho da luz LED para as dimensões desejadas (configuração 5 neste experimento).
7. Perfure a zona de cada óvulo fertilizado três vezes com o laser. A zona pode ser perfurada ou diluída. Usando as configurações acima, o laser produzirá um orifício com um diâmetro de 10 μm (Figura 1).
   nota: Mirar perto do corpo polar mantém o laser longe da célula embrionária.
8. Deixe os óvulos fertilizados se recuperarem por 2 h na incubadora de cultura de tecidos antes de passar para a próxima etapa.

2. Transdução de óvulos fertilizados com camundongos após perfuração a laser XYClone

1. Pipetar 2 μL de lentivírus concentrado (maior que 1e8 TU / mL título) na gota de 50 μL de KSOM. Não pipete para cima e para baixo. Os ovos fertilizados se ligam prontamente à ponta da pipeta. Com base em nossa experiência, 1e5-5e5 unidades de transdução de lentivírus em um volume inferior a 3 μL é ideal para a entrega de genes.
2. Deixe os ovos fertilizados se desenvolverem em blastocisto por 4 dias na incubadora. Não há necessidade de mudar a mídia.

3. Transferência não cirúrgica de embriões de camundongos transduzidos para camundongos pseudo-prenhes

1. Use camundongos pseudográbeis, 3,5 dias após o acasalamento.
2. Use o dispositivo de transferência de embriões não cirúrgicos (NSET) para implantar embriões de camundongos em camundongos pseudo-gránhes.
   1. Usando um microscópio cirúrgico ou de dissecação, insira um espéculo vaginal para visualizar o colo do útero.
   2. Insira o dispositivo de transferência não cirúrgica de embriões (NSET) aproximadamente 5 mm no colo do útero e deposite os embriões em um volume de aproximadamente 2 μL.
      nota: Um dispositivo NSET estéril é usado para cada transferência e descartado após o procedimento. Todos os reagentes utilizados na manipulação dos embriões devem ser estéreis.
3. Transfira 10-15 blastocisto saudável em 2 μL de volume de KSOM para cada camundongo pseudo-grávido.
4. Continue monitorando e medindo o ganho de peso em camundongos pseudográvidos nos dias seguintes para determinar se o NSET foi bem-sucedido.
5. Recupere os filhotes permitindo que as ratas grávidas dêem à luz naturalmente ou realizando uma cesariana 17 dias após a transferência do embrião. Uma cesariana geralmente é necessária se houver poucos embriões e eles crescerem demais para o parto natural.
6. Colete tecido de filhotes para genotipagem para determinar a taxa de transgênese.

Resultados

Figura 1: Tratamento a laser de ovos fertilizados com camundongos. Exemplos de perfuração da zona para produzir um buraco versus desbaste da zona.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Plasmídeo CD510B-1	Biociências do Sistema	CD510B-1	usado para empacotar o lentivírus que expressa EF1a-copGFP
Dimetilpolissiloxano	sigma	DMPS5X	cultura de embriões
Laser XYClone	Hamilton Thorne Biociências		Perfuração de ovos fertilizados com camundongos
Dispositivo de transferência de embriões não cirúrgico (NSET)	ParaTechs	Nº 60010	NSET de embriões
KSOM médio	Millipore	MR-020P-5F	cultura de embriões
Composição do KSOM:			mg/100mL
NaCl			555
Kcl			18.5
KH2PO4			4.75
MgSO4 7H2O			4.95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
glicose			3.6
Na-piruvato			2.2
Ácido DL-Láctico, sal de sódio			0,174mL
EDTA de 10 mM			100μL
estreptomicina			5
penicilina			6.3
0,5% de fenol vermelho			0,1mL
L-Glutamina			14.6
Aminoácidos essenciais MEM			1mL
MEM AA não essencial			0,5mL
Bsa			100