Transferência de genes mediada por biolística: uma técnica para entregar genes de interesse em células-alvo por meio de uma arma de genes biolísticos

Resumo

Fonte: Taylor, T., et al. Transformação biolística de um gene marcado com fluorescência no patógeno fúngico oportunista Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (2015).

Neste vídeo, demonstramos o protocolo de entrega de genes mediada por arma de genes biolísticos em células cultivadas. Este método fornece um método simples de transformação genética estável usando uma quantidade mínima de DNA.

Protocolo

1. Preparação de DNA

1. Prepare discos biolísticos macrotransportadores laranja submergindo-os em etanol 100% usando fórceps. Coloque os discos em uma placa de Petri grande contendo drierita para secar (certifique-se de que a drierita não toque nos discos).
2. Depois de secos, pressione os discos macrotransportadores nos suportes de disco de prata (previamente limpos com 100% de etanol).
3. Grânulos microtransportadores de ouro de vórtice suspensos em etanol 100% e alíquota de 12 μl em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, um tubo por transformação.
4. Adicione a cada tubo em ordem: 2 μg de DNA (de preferência 2 μl de 1 μg / μl de DNA), 10 μl 2,5 M CaCl₂ e 2 μl 1 M base livre de espermidina.
5. Configure um controle negativo como na etapa 1.4, mas sem DNA.
6. Agite cada tubo e incube em temperatura ambiente por 5 min. Agite suavemente cada tubo ocasionalmente para ressuspender as contas sedimentadas durante esta incubação.
7. Gire os tubos a 225 x g por 30 segundos para pellet as contas de ouro revestidas de DNA. Remova cuidadosamente o sobrenadante (por pipetagem ou aspiração) e descarte.
8. Ressuspenda completamente os grânulos em 600 μl de etanol 100% pipetando lentamente para cima e para baixo.
9. Gire os tubos a 225 x g por 30 segundos para pellet as contas sem embalar. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
10. Ressuspenda as esferas de ouro revestidas de DNA em 8 μl de etanol 100% pipetando lentamente para cima e para baixo.
11. Pipetar as esferas de ouro revestidas com ADN para o centro do disco biolítico com um diâmetro de 1 cm e deixar secar.
    nota: Um círculo de ouro seco visível no centro do disco biolístico indica que uma concentração suficiente de contas de ouro está presente.
    nota: Os discos macrotransportadores carregados com contas de ouro revestidas de DNA estão agora prontos para uso com a arma genética.

2. Operando a arma genética

1. Ligue a bomba de vácuo.
2. Ligue o gás hélio girando o botão no sentido anti-horário até que uma pressão de aproximadamente 2,200 psi seja atingida no manômetro.
3. Ligue a arma genética girando o botão vermelho à esquerda.
4. Certifique-se de que as taxas de fluxo do vácuo e da ventilação sejam ajustadas para que o vácuo atinja 28 polegadas Hg em 15 segundos.
5. Certifique-se de que a distância entre o disco de ruptura e o macroportador seja de aproximadamente 3/8 de polegada.
6. Limpe toda a câmara com etanol.
7. Mergulhe os discos de ruptura em etanol 100%. Deixe secar em uma superfície estéril (por exemplo, placa de Petri).
8. Use uma chave de torque para soltar o suporte do disco de ruptura. Insira um disco de ruptura limpo no suporte. Aparafuse o suporte do disco de ruptura de volta no lugar e aperte com a chave de torque girando-o uma vez para a direita.
   nota: Os discos de ruptura serão substituídos após cada filmagem.
9. Mergulhe as telas de malha em 100% de etanol. Deixe secar em uma superfície estéril (por exemplo, placa de Petri).
10. Depois de seco, coloque uma tela de malha lavada na placa de montagem de plástico branco. Coloque o suporte do disco macrostransportador com o lado do DNA voltado para baixo na câmara do disco. Aparafuse a tampa prateada e coloque a placa de montagem no slot mais alto.
    nota: A tela de malha será substituída após cada filmagem.
11. Coloque uma placa de ágar YPD contendo 1 M de sorbitol na placa inferior.
12. Feche a porta da câmara e trave no lugar.
13. Empurre e segure o interruptor vermelho do meio para cima para ativar o vácuo e permitir que o vácuo atinja 28 polegadas Hg. Assim que o nível de vácuo adequado for atingido, mova esta chave para a posição para baixo. Quando estiver pronto, mantenha pressionado o botão vermelho à direita para disparar. Quando o disco de ruptura estourar, solte imediatamente o botão de disparo e empurre o interruptor vermelho do meio para a posição central para ventilar a câmara a 0 psi.
14. Limpe os detritos do disco de ruptura e desligue a pistola genética. Em seguida, desligue o gás hélio girando o botão no sentido horário e, finalmente, desligue a bomba de vácuo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Contas de ouro de 0,6 μm	Bio-Rad	165-2262	http://www.bio-rad.com
Base sem espermidina	Sigma- Aldrich	S0266	https://www.sigmaaldrich.com
Discos de ruptura de 1350 psi	Bio-Rad	165-2330	http://www.bio-rad.com
Parando telas	Bio-Rad	165-2336	http://www.bio-rad.com
Discos macrocarriers	Bio-Rad	Rolamento 165-2335	http://www.bio-rad.com
Sistema PDS-1000/He	Bio-Rad	Rolamento 165-2257	http://www.bio-rad.com
Centrífuga Microfuge 18	Beckman Coulter	F241.5P	www.beckmancoulter.com