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1. Revestimento de Pratos de Poli-ornitina/Laminina (Po/L)
NOTA: Os volumes são adaptados para revestir uma placa de 24 poços.
- Se necessário, coloque uma lamínula estéril de 12 mm no poço.
- Cubra os alvéolos com 500 μL de solução de poli-L-ornitina a 10 μg/mL dissolvida em água.
- Deixe os poços assentarem em temperatura ambiente por 1 h.
- Remova a solução de poli-L-ornitina e seque ao ar por 30 min.
- Revestir os alvéolos durante a noite a 37 °C com 500 μL de 3 μg/ml de laminina em bicarbonato L-15.
nota: Os poços podem ser armazenados a 37 °C por 7 dias na incubadora. Para incubações longas, a adição de PBS estéril entre os poços pode ajudar a evitar a evaporação do meio.
2. Cultura de neurônios motores
- Dilua os MNs para a densidade apropriada, geralmente 5.000 a 10.000 células em 500 μL de meio de cultura por poço em uma placa de 24 poços.
nota: A densidade de semeadura é de cerca de 30.000 e 1.500 células para placas de 6 e 96 poços, respectivamente.
- Remova a solução de laminina com um P1000.
- Transfira imediatamente os MNs diluídos em meio de cultura para as placas de revestimento para evitar a secagem.
- Incubar a cultura durante 2 dias a 37 °C.
3. Magnetofecção de neurônios motores
NOTA: Nas etapas a seguir, as quantidades utilizadas destinam-se à transfecção de um poço de uma placa de 24 poços. Consulte o protocolo do fabricante para outro formato.
- Para a preparação do DNA, ressuspenda 1 μg de DNA em 50 μL de meio de cultura neuronal e vórtice por 5 s. Aqui, são usados plasmídeos de 9 kb com um promotor CAGGS (pCAGEN) controlando o cDNA do neurofilamento.
- Para a preparação do tubo de contas, ressuspenda 1,5 μL de esferas em 50 μL de meio de cultura neuronal.
- Adicione a solução de 50 μL à solução de DNA de 50 μL e incube por 20 min à temperatura ambiente (volume total = 100 μL).
- Durante esta incubação, retirar 100 μL de meio de cultura do poço que será transfectado.
NOTA: Coloque a placa magnética na incubadora para aquecê-la a 37 °C.
- Transfira 100 μL da mistura de DNA / grânulo para o poço e incube a placa 20–30 min na placa magnética a 37 ° C.