1. Preparar construto retroviral
- Subclonar as cadeias alfa e beta do receptor de células T (TCR), separadas por um ligante 2A, em um vetor retroviral baseado em MSCV (exemplo, pMIAII ou pMIGII).
nota: O ligante 2A permite a expressão estequiométrica e concordante das cadeias TCR alfa e beta a partir de um único quadro de leitura aberto. O vetor inclui um de proteína fluorescente IRES (ametrina ou GFP) que é usado para rastrear células transduzidas e eficiência de transdução.
- Isole o DNA do plasmídeo usando um kit de preparação de plasma obtido comercialmente ou um produto similar. Use uma concentração de trabalho de 1-2 μg μl-1.
2. Geração de Linhagens Celulares Produtoras de Retrovirais
- Utilize um processo de duas etapas para produzir as linhagens celulares produtoras retrovirais.
- Gerar retrovírus por transfecção transitória de células 293T com três plasmídeos (pVSVG, pEQ-Pam3(-E) e vetor de interesse) e retirar o sobrenadante retroviral das células 293T para transduzir a linhagem celular produtora retroviral ecotrópica GP+E86.
- Isole os 40% principais das células produtoras de GP+E86 com expressão fluorescente por FACS e propague as células produtoras de GP+E86 transduzidas como fonte do vírus.
nota: A geração de produtores de alto título é fundamental para a transdução eficiente das células da medula óssea.
3. Transferência de genes de células-tronco mediada por retrovírus (dia -5)
- Descongelar e cultivar 0,5 -1,0 x 10,6 de cada linhagem celular produtora de GP+E86 em DMEM 10% (vol/vol) FBS completo para permitir crescimento suficiente para duas placas confluentes de 150 mm até o Dia 0 deste protocolo.
nota: O descongelamento de 0,5 - 1,0 x 106 de cada linha celular produtora de GP + E86 em uma placa de 10 cm permitirá 30 - 50% de confluência no Dia 5. Isso também permite 5 dias de cultura para expandir as linhas celulares produtoras de GP+E86 para duas placas confluentes de 150 mm no Dia 0.
- Cultura de linhagem celular produtora retroviral em meio de cultura de tecidos completos contendo 5% de soro fetal de bezerro e ciprofloxacino (10 μg/ml) para evitar contaminação por micoplasma.
nota: Interrompa o uso de ciprofloxacina ao gerar o sobrenadante viral para transdução da medula óssea. Evite o crescimento excessivo da linhagem celular produtora, pois isso afetará negativamente a eficiência da transdução da medula óssea.
4. Cultura de células produtoras retrovirais (dia 0)
- Placa 3 x 106 células produtoras de retrovirais por placa de 150 mm em 18 ml de DMEM completo 20% (vol/vol) FBS.
- Incubar células produtoras retrovirais a 37 °C durante a noite. Antecipe uma placa de 150 mm para 15 milhões de células da medula óssea (aproximadamente 2-3 camundongos doadores).
5. Sobrenadante Retroviral (Dia 1)
- No dia seguinte (aproximadamente 24 horas mais tarde), colher o sobrenadante retroviral das placas produtoras (definidas na etapa 4) retirando o sobrenadante retroviral diretamente da placa de 150 mm com uma seringa de 10 ml e filtrando usando um filtro de seringa de 0,45 μm.
- Substitua cuidadosamente o sobrenadante retroviral removido por 18 ml de DMEM completo fresco a 20% (vol/vol) FBS.
- Suplementar o sobrenadante retroviral filtrado com IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1), MSCF (50 g ml-1) e brometo de hexadimerina (Polybrene) (6 μg ml-1).
nota: O brometo de hexadimetrina deve ser feito fresco a cada 2 meses para evitar uma queda na eficácia da transdução retroviral.
6. Sobrenadante e Transdução Retroviral (Dia 2)
- Após 24 horas, recolher sobrenadante viral fresco da linha celular produtora viral. Filtrar o sobrenadante retroviral com uma seringa de 10 ml e um filtro de seringa de 0,45 μm. Suplementar o sobrenadante retroviral filtrado com IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) e SCF (50 g ml-1) e brometo de hexadimerina (6 g ml-1).
- Em seguida, remova cuidadosamente com uma pipeta ou aspire os 2 ml superiores de meio de cada poço da placa de seis poços contendo as células da medula óssea.
nota: Trabalhe com cuidado para não aspirar a medula óssea, que geralmente se concentra no meio do poço. Alternativamente, o sobrenadante removido pode ser girado para recuperar quaisquer células perdidas da medula óssea.
- Em cada poço da placa de 6 poços da medula óssea, adicione 3 ml de sobrenadante viral fresco contendo citocinas e brometo de hexadimerina. Embrulhe as placas em plástico e repita a transdução de spin a 1.000 x g por 60 min a 37 °C. Desembrulhe as placas e incube as células a 37 °C e 5% de CO2 durante a noite (cerca de 24 horas).
7. Adição de DMEM suplementado fresco (dia 3)
- Após 24 horas, remova os 2 ml superiores de meio de cada poço da placa de seis poços contendo as células da medula óssea, como na etapa 6.2. Substitua o meio removido por DMEM fresco 20% (vol / vol) FBS suplementado com concentrações finais de IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) e SCF (50 g ml-1).
- Incubar placas de medula óssea a 37 °C CO2 incubadora por mais 24 horas.
