Purificação de proteínas baseada em cromatografia de troca aniônica: uma técnica de separação para isolar uma proteína de interesse do lisado bacteriano dialisado com base na carga líquida

Resumo

Fonte: Fuehner, S., et al. Purificação de S100A12 humanos e seus oligômeros induzidos por íons para estimulação de células imunes J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, demonstramos uma técnica de cromatografia de troca aniônica para purificar a proteína de ligação ao cálcio humano S100A12 com base na carga superficial líquida da proteína de uma cultura de Escherichia coli.

Protocolo

1. Purificação de Proteínas

1. Cromatografia de troca aniônica
   1. diálise
      1. Preparar o tampão A da cromatografia de permuta aniónica (AIEX) dissolvendo 20 mM de Tris, 1 mM de EDTA e 1 mM de ácido etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N, N, N', N'-tetracético (EGTA) em água desionizada e ajustar o pH para 8,5 com HCl. Para diálise, preparar 2 x 5 L e para cromatografia 2 x 1 L de tampão AIEX A.
         nota: O volume do dialisato deve ser cerca de 100 vezes o volume da amostra. Todos os tampões usados para cromatografia devem ser filtrados (0,45 μm ou menos) e desgaseificados (por exemplo, por banho ultrassônico ou desgaseificação a vácuo).
      2. Corte o tubo de diálise (corte de peso molecular [MWCO]: 3,5 kDa) em um comprimento apropriado com espaço adicional para o ar para garantir a flutuabilidade da amostra acima da barra de agitação rotativa.
         nota: O glicerol preserva a membrana e deve ser removido antes do uso.
      3. Para reduzir a viscosidade da solução de proteína depurada, diluir a solução com 25 ml de tampão AIEX A para facilitar a aplicação subsequente na coluna de cromatografia. Prenda o primeiro fechamento no tubo, carregue a amostra na membrana e prenda o segundo fechamento a pelo menos 1 cm da extremidade superior do tubo.
      4. Coloque o recipiente de 5 L com tampão AIEX A em uma placa de agitação, adicione uma barra de agitação e a membrana cheia de solução de proteína. Ajuste a velocidade para girar a amostra, evitando interferência com a barra de agitação rotativa. Dialisar durante 12−24 h a 4 °C, depois substituir o tampão dialisato (tampão AIEX A) por uma nova preparação pré-arrefecida e continuar durante pelo menos 4 horas adicionais. Transferir a solução proteica dialisada para um tubo de 50 ml e filtrar através de uma unidade filtrante de 0,45 μm.
         nota: Armazenamento possível.
   2. cromatografia
      1. Inicie o sistema de cromatografia líquida (FPLC) com manutenção geral, conecte os tampões de coluna AIEX A e AIEX B (tampão AIEX A com NaCl 1 M) e a coluna contendo resina de troca aniônica. Consulte a Tabela 1 para parâmetros cromatográficos gerais.
         nota: Os tampões, a coluna e o equipamento FPLC devem ser equilibrados à mesma temperatura antes de iniciar a execução (consulte os parâmetros cromatográficos na Tabela 1, Tabela 2).
      2. Equilibre a coluna com o tampão AIEX A, em seguida, carregue a amostra na coluna e elua as proteínas com um gradiente linear de 0% a 100% de tampão com alto teor de sal (AIEX B). Consulte a Tabela 2 para obter um protocolo de método detalhado.
      3. Colete 2 mL frações durante a eluição e analise 10 μL de cada fração em uma eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio a 15% corada com Coomassie (SDS-PAGE). Agrupe as frações contendo S100A12 proteína para diálise.
         nota: O peso molecular do S100A12 é 10.575 Da.

Resultados

Tabela 1: Informações detalhadas sobre os parâmetros aplicados da cromatografia de troca aniônica.

...

Volume do leito (CV)	75 mL
monitor	Absorbância a 280 nM
Pressão máxima	3 bar
Buffer de coluna A	20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,5

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
25% HCl	Carl Roth	X897.1
4&menos; 20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels	BioRad
Solução Descolorante Coomassie Briliant Blue R250	BioRad
Solução de Coloração Coomassie Briliant Blue R250	BioRad
EDTA sal dissódico di-hidratado	Carl Roth	8043.1
EGTA	Carl Roth	3054.3
Q Sepharose Fluxo Rápido	GE Healthcare	17-0510-01	Resina para cromatografia de troca aniônica
Cloreto de sódio (NaCl)	Carl Roth	3957.2
Hidróxido de sódio	Carl Roth	P031.1
Base Tris	Carl Roth	4855,3
0,45 µ M Filtro de Seringa	Merck
copo de medição de 5 L	Carl Roth	CKN3.1
50 mL	Corning
Fechamentos de Tubos de Diálise	Espectro
Tubos coletores de frações 5 mL	Greiner
Membrana de Diálise Spectra/Por (3,5 kDa)	Spectrum
Unidade de filtro Steritop	Merck	SCGPT01RE
Ä Purificador KTA UPC 10	GE Healthcare		Coletor de frações do sistema FPLC
	GE Healthcare	Frac-920
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658000EDU
Nanofotômetro	Implen	P330
	Knick	765

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