Cromatografia de interação hidrofóbica dependente de cálcio: uma técnica para purificar proteínas de ligação ao cálcio com base em interações hidrofóbicas

Resumo

Fonte: Fuehner, S., et al., Purificação de S100A12 humanos e seus oligômeros induzidos por íons para estimulação de células imunes. J. Vis. Exp. (2019).

Neste vídeo, demonstramos a purificação da proteína de ligação ao cálcio de um lisado de células dialisadas por meio de cromatografia de interação hidrofóbica dependente de cálcio. As proteínas de ligação ao cálcio expõem uma região hidrofóbica ao se ligarem ao cálcio, facilitando a interação com um grupo hidrofóbico na resina. Posteriormente, essas proteínas são eluídas usando quelante de cálcio EDTA que reverte a interação.

Protocolo

1. Cromatografia de interação hidrofóbica dependente de cálcio (HIC)

1. diálise
   1. Dialisar a solução proteica contra 20 mM de Tris, 140 mM de NaCl, pH 7,5
2. cromatografia
   1. Prepare 1 L de tampão cromatografia HIC A dissolvendo 20 mM de Tris, 140 mM de NaCl e 25 mM de CaCl2 em água deionizada e ajuste o pH para 7,5. Para o tampão HIC B, dissolver 20 mM de Tris, 140 mM de NaCl e 50 mM de EDTA. Ajuste o pH para 7,0 e filtre e desgaseifique os tampões. Adicionar CaCl2 à amostra até uma concentração final de 25 mM e filtrar através de 0,45 μm. Equilibre os tampões HIC e a amostra a 4 °C (temperatura da coluna).
   2. Inicie o sistema de cromatografia líquida com manutenção geral, conecte os tampões de coluna HIC A e B e a coluna. Consulte a Tabela 1 para mais parâmetros cromatográficos.
   3. Equilibre a coluna, carregue a amostra e estenda o bloco 'lavar amostra não ligada' até que o sinal UV atinja o nível de linha de base novamente. Em seguida, inicie a eluição com um quelante de cálcio contendo tampão (EDTA). Consulte a Tabela 2 para obter um protocolo de método detalhado.
      nota: Experimentos anteriores mostraram que um excesso de cálcio parece ser benéfico para a ligação de S100A12 à resina de cromatografia.
   4. Colete frações de pico de 2 mL e analise 10 μL de cada fração em um SDS-PAGE de 15% corado com Coomassie. Agrupar frações de S100A12 puras e dialisar contra solução salina tamponada com hepes (HBS; Hepes 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,0).
      nota: O coeficiente de extinção do S100A12 monomérico é 2980 M-1 cm-1.

Resultados

Tabela 1: Informações detalhadas sobre os parâmetros aplicados da cromatografia de interação hidrofóbica.

bloquear	volume	buffer	tomada
Equilibration	1−2 volumes de coluna (CVs)	um	desperdício
Carg...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
químico
Sal dissódico EDTA di-hidratado	Carl Roth	8043.1
Fenil Sepharose de alto desempenho	GE Saúde	17-1082-01	Resina para cromatografia de interação hidrofóbica
Cloreto de sódio (NaCl)	Carl Roth	3957.2
hidróxido de sódio	Carl Roth	Pág. 031.1
Base Tris	Carl Roth	Rolamento 4855.3
25% HCl	Carl Roth	X897.1
Di-hidrato de cloridrato de cálcio	Carl Roth	Rolamento 5239.1
Material de laboratório
Filtro de seringa de 0,45 μm	Merck	SLHA033SS
Tubos de fundo redondo de 14 mL	Bd	352059
Balão Erlenmyer de 2 L	Carl Roth	LY98.1
Tubos coletores de frações 5 mL	Greiner	115101
Membrana de diálise Spectra/Por (3,5 kDa)	espectro	132724
Unidade de filtro Steritop	Merck	SCGPT01RE
equipamento
Coletor de frações	GE Saúde	Frac-920