Purificação de proteínas baseada em cromatografia de afinidade de níquel: uma técnica para purificar proteínas recombinantes marcadas com poli-histidina a partir de lisado de células bacterianas

Resumo

Fonte: Pokhrel, A. et al. Um ensaio Purificação e atividade in vitro para uma (p)ppGpp sintetase de Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, demonstramos a técnica de cromatografia de afinidade de níquel para purificar enzimas pirofosfoquinase marcadas com histidina da bactéria Clostridium difficile.

Protocolo

1. Purificação de proteínas por cromatografia de afinidade de níquel

1. Purifique a proteína usando 1 mL de resina de ácido nitriloacético (Ni-NTA) em uma coluna de gravidade.
   1. No dia anterior ao uso, equilibre a coluna durante a noite a 4 ° C com 2 mL de tampão de equilíbrio (10 mM Tris-HCl pH 7,79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 0,5 mg / mL de lisozima, 5 mM MgCl₂, 10 mM de imidazol, 0,25 mM de DTT, 5 mM de fluoreto de fenilmetano sulfonil (PMSF), 10% de glicerol).
   2. No dia seguinte, levar a coluna de 4 °C para RT antes de carregar o lisado clarificado e deixá-la repousar durante ~2–3 h.
      nota: Trazer a coluna ao equilíbrio térmico é crucial para evitar a formação de bolhas de ar dentro da coluna.
   3. Ressuspenda o pellet no tampão de lise (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, 10% de glicerol, 0,5 mg / mL de lisozima, 10 mM de imidazol, 0,25 mM de DTT e 5 mM de PMSF).
   4. Sonicar células em gelo por intervalos de 8 x 10 s, pausando 30 s entre os pulsos.
   5. Clarificar o lisado por centrifugação a 3,080 x g durante 30 min a 4 °C, utilizando uma microcentrífuga.
   6. Preparar o lisado com volumes iguais de tampão de lise, aplicar o lisado clarificado preparado na coluna e recolher o fluxo.
   7. Reaplique o fluxo de lisado clarificado na coluna e colete o fluxo secundário.
   8. Lave a coluna com tampão de lavagem 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, 30 mM imidazol, 10% glicerol). Coletar o fluxo.
      NOTA: A inclusão de 5 mM MgCl₂ nos tampões de lavagem e eluição é importante para a atividade enzimática da proteína purificada.
   9. Lavar a coluna com tampão de lavagem 2 [Tris-HCl 10 mM (pH 7,79), NaCl 300 mM, MgCl 5 mM₂, NaH 2 PO₄ 50 mM e imidazol 50 mM).
   10. Colete o fluxo.
   11. Aplicar 2 mL de tampão de eluição (10 mM de Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM de NaCl, 50 mM de NaH₂PO₄, 10% de glicerol e 75 mM de imidazol). Coletar fluxo em duas frações de 1 mL cada.
       nota: A coluna após esta etapa pode ser armazenada em tampão de equilíbrio a 4 °C se a mesma proteína for purificada no próximo ensaio de purificação. A coluna pode ser usada até 3 vezes se armazenada corretamente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Resina Ni-NTA	G Biociências	786-940/941
Colunas descartáveis de gravidade Pierce, 10 mL	Thermo Científico	Nº 29924
1 mL de dispositivo de diálise Spectra/ Por float-A-lyzer G2 (MWCO: 20 kD)	espectro	G235033
Processador ultrassônico	Sonics	VC-750
Microcentrífuga com rotor D3024/D3024R	Scilogex