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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Extração do total de lipídios não covalentes de micobactérias (Figura 1)
- Raspe 0,2 g de micobactérias de um meio sólido e adicione a um tubo de vidro com tampas de rosca de revestimento de politetrafluoretileno (PTFE). Adicione uma solução composta por 5 mL de clorofórmio e 10 mL de metanol (clorofórmio: metanol, 1: 2).
nota: Quando solventes orgânicos são usados, apenas recipiente de vidro deve ser usado. Não são permitidos recipientes de plástico. Além disso, são necessárias tampas de rosca de revestimento de PTFE para garrafas.
cuidado: O clorofórmio é uma substância potencialmente tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
cuidado: O metanol é uma substância potencialmente tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamento de proteção individual apropriado (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
- Deixe o tubo em constante agitação durante a noite para extrair lipídios não ligados à covalente da superfície celular micobacteriana.
nota: Se uma plataforma de agitação orbital não estiver disponível, a agitação constante pode ser substituída por agitação manual periódica com a maior frequência possível.
- Cubra um funil de vidro com um papel de filtro, filtre os solventes orgânicos e colete-os em um tubo de vidro.
- Use um fluxo de gás nitrogênio para evaporar a fase líquida no tubo. Encher o tubo com gás azoto, tapá-lo e armazená-lo a 4 °C.
nota: Conecte uma pipeta Pasteur de vidro ao fluxo de gás nitrogênio para evaporar especificamente o tubo desejado. Além disso, mantenha o tubo dentro de um aquecedor de bloco seco para tubos a 37 °C. Quando o solvente evaporar, encha o tubo com gás nitrogênio antes de fechá-lo.
- Adicionar 15 ml de uma solução de clorofórmio:metanol (2:1) aos restos celulares. Deixe o tubo em agitação constante durante a noite para extrair lipídios não ligados à covalente da superfície celular da micobactéria.
nota: Se uma plataforma de agitação orbital não estiver disponível, a agitação constante pode ser substituída por agitação manual periódica com a maior frequência possível.
- Deixe a mistura descansar por 1 h. Com uma pipeta Pasteur, recupere os solventes orgânicos. Cobrir um funil de vidro com um papel de filtro e filtrar os solventes orgânicos e recolhê-los no mesmo tubo de vidro utilizado anteriormente no passo 1.3. Use um fluxo de gás nitrogênio para evaporar a fase líquida no tubo. Encher o tubo com gás azoto, fechá-lo e guardá-lo novamente a 4 °C.
2. Extração de ácido micólico por metanólise ácida (Figura 2A)
- Adicione 2-5 mL de solução esterificante em um tubo de vidro hermético com uma tampa de rosca de revestimento de PTFE. Adicione 0,2 g de biomassa de micobactérias no tubo de vidro.
nota: A solução esterificante é formada pela mistura de 30 mL de metanol, 15 mL de tolueno e 1 mL de ácido sulfúrico. As células de micobactérias podem ser retiradas de culturas sólidas ou, mesmo de células deslipidadas, após a extração de lipídios totais não covalentes de micobactérias (células remanescentes após a filtragem na etapa 1.6).
cuidado: O tolueno é uma substância inflamável e extremamente perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
cuidado: O ácido sulfúrico é uma substância corrosiva e perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamento de proteção individual apropriado (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
- Misture o conteúdo por vórtice. Deixe a mistura repousar dentro de um banho seco a 80 °C durante a noite.
- Deixe o tubo esfriar até atingir a temperatura ambiente e, em seguida, adicione 2 mL de n-hexano ao tubo. Misture o conteúdo por vórtice por 30 s e deixe o tubo assentar até que duas fases claras apareçam.
CUIDADO: o n-hexano é uma substância potencialmente inflamável, irritante, prejudicial ao meio ambiente e extremamente perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamento de proteção individual apropriado (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
- Recuperar a fase superior correspondente à fase n-hexano. Transfira-o para um novo tubo.
- Repita a etapa 2.3. Recupere novamente a fase superior e transfira-a para o mesmo tubo usado na etapa 2.4.
- Evaporar o conteúdo do tubo utilizando um fluxo de azoto. Encha o tubo com gás nitrogênio, feche-o e armazene-o a 4 °C.
3. Extração de ácido micólico por saponificação e metilação (Figura 2B)
- Raspe 0,2 g de micobactérias de um meio sólido e adicione a um tubo de vidro com uma tampa de rosca de PTFE.
- Adicione 2 mL de solução de metanol-benzeno (80:20) contendo hidróxido de potássio a 5%. Misture o conteúdo por vórtice. Aquecer a mistura durante 3 h a 100 °C.
cuidado: O benzeno é uma substância inflamável, cancerígena e perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamento de proteção individual apropriado (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
- Deixe o tubo esfriar até a temperatura ambiente. Adicione 20% de ácido sulfúrico para acidificar as amostras para atingir pH = 1.
- Adicione 3 ml de éter dietílico. Misture delicadamente o conteúdo por vórtice.
- Deixe as duas fases se formarem por liquidação. Recuperar a fase éter dietílico e transferir para um novo tubo. Repita a etapa de lavagem por um total de três vezes.
- Lavar o extracto de éter dietílico com 2 ml de água destilada e transferir a parte superior correspondente ao éter dietílico para um novo tubo. Repita a etapa de lavagem por um total de três vezes.
- Adicione 2 g de sulfato de sódio anidro sobre o extrato de éter dietílico para secá-lo.
- Filtre a suspensão. Evaporar o conteúdo com um fluxo de nitrogênio.
- Para realizar a etapa de metilação, dissolver 3 g de N-nitroso-N-metil ureia em uma solução pré-resfriada formada por 45 mL de éter dietílico e 9 mL de KOH 40% em água destilada.
cuidado: A N-nitroso-N-metilureia é uma substância tóxica, irritante, cancerígena e perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamento de proteção individual apropriado (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
- Transferir o sobrenadante (diazometano) para um novo balão arrefecido em gelo contendo pastilhas de hidróxido de potássio (cerca de 30 g).
nota: Se o sobrenadante não for usado imediatamente, ele pode ser armazenado a -20 °C por no máximo 1 h.
cuidado: Os pellets de hidróxido de potássio são uma substância irritante e corrosiva. Este material deve ser utilizado em uma capela de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
cuidado: O diazometano é altamente tóxico e potencialmente explosivo. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar com vidro de segurança usando equipamento de proteção individual apropriado (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
- Adicionar 2 ml da solução etérea contendo diazometano, obtida no passo 3.10, ao extracto etéreo dietílico seco que contém ácidos micólicos, obtido no passo 3.8. Incubar por 15 min em temperatura ambiente.
- Evaporar a suspensão a 40 °C. Encher o tubo com gás azoto, fechá-lo e armazenar os lípidos metilados a 4 °C.
nota: Evaporar o diazometano da solução de éter sob a capela de fluxo laminar, até que o éter perca a cor amarela.
4. Análise por cromatografia em camada delgada (TLC)
- Sature a câmara de vidro TLC. Para isso, cobrir uma das paredes da câmara de TLC com um pedaço de papel de filtro e deixá-la entrar em contacto com a fase móvel composta pela mistura de solventes. Coloque o volume restante do solvente no fundo da câmara TLC.
nota: O fundo da câmara de TLC deve ser coberto por pelo menos 1 cm da fase móvel. Nos experimentos atuais, diferentes fases móveis foram usadas para desenvolver os TLCs. Eles consistiam em 85 mL de n-hexano mais 15 mL de éter dietílico; 100 mL de diclorometano; 90 mL de clorofórmio, 10 mL de metanol e 1 mL de água; 30 mL de clorofórmio, mais 8 mL de metanol e 1 mL de água; 60 mL de clorofórmio, mais 35 mL de metanol e 8 mL de água; 95 mL de clorofórmio mais 5 mL de metanol; e 90 mL de éter de petróleo (60-80 °C) mais 10 mL de éter dietílico.
nota: No TLC bidimensional, use n-hexano: acetona (95: 5) na primeira direção três vezes e use um único desenvolvimento com tolueno: acetona (97: 3) na segunda direção para analisar a composição do ácido micólico. Para analisar os PIMs, use clorofórmio: metanol: água (60: 30: 6) na primeira direção uma vez e use clorofórmio: ácido acético: metanol: água (40: 25: 3: 6) na segunda direção. Para analisar PDIM e AG, usar éter de petróleo (60-80 °C):acetato de etila (98:2) na primeira direção três vezes, e usar um único desenvolvimento com éter de petróleo (60-80 °C):acetona (98:2) na segunda direção.
cuidado: O éter dietílico é uma substância potencialmente tóxica e perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
cuidado: O diclorometano é uma substância potencialmente tóxica e perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
cuidado: O éter de petróleo é uma substância potencialmente inflamável, prejudicial ao meio ambiente e extremamente perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
cuidado: O ácido acético é uma substância potencialmente inflamável e corrosiva. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
cuidado: O acetato de etila é uma substância inflamável e perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
cuidado: A acetona é uma substância inflamável e perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamento de proteção individual apropriado (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
- Feche a câmara TLC para saturá-la por pelo menos 20 min. Enquanto isso, dissolver os lipídios presentes no tubo de vidro em 0,2-1 mL de clorofórmio.
nota: O volume usado para dissolver os lipídios pode ser modificado dependendo da concentração desejada ou esperada da amostra.
- Aplique 10 μL de cada suspensão usando um tubo de vidro capilar diretamente na placa TLC e deixe a amostra secar por 5 min em temperatura ambiente.
nota: As amostras devem ser aplicadas na parte inferior da placa, deixando 1 cm de cada lado. As amostras devem ser separadas umas das outras durante pelo menos 0,5 cm. Uma vez que a amostra é aplicada na placa, os tubos podem ser evaporados novamente com gás nitrogênio e armazenados a 4 °C para uso posterior.
- Insira a placa na câmara TLC saturada contendo a fase móvel. Permitir que a fase móvel seja executada através do TLC.
nota: Qualquer movimento aplicado à câmara TLC afeta o solvente em funcionamento na placa e afeta a mobilidade lipídica. No caso de realizar TLC bidimensional, duas câmaras de TLC são necessárias para conter ambos os sistemas de eluição.
- Remova a placa da câmara TLC quando o solvente atingir 1 cm de distância da extremidade superior da placa. Deixe a placa sob fluxo laminar até que a sílica esteja totalmente seca.
nota: No caso de análise da composição do ácido micólico, usando n-hexano e éter dietílico (85:15), repita os passos 4.4 e 4.5 duas vezes mais, até executar a fase móvel três vezes sobre a placa de TLC.
- Revele a placa com a mancha necessária; aqueça a placa, se necessário.
nota: No presente experimento, 15-20 mL das seguintes soluções foram usadas para pulverizar as placas de TLC: hidrato de ácido molibdatofosfórico a 10% em etanol até que a placa fique amarela brilhante, seguido de aquecimento da placa a 120 ° C; 5% em etanol de 20% de α-naftol em ácido sulfúrico seguido de aquecimento da placa a 120 °C; Reagente azul de molibdênio (óxido de molibdênio a 1,3% em ácido sulfúrico 4,2 M) até o aparecimento de bandas de fosfato ou antrona a 1% em ácido sulfúrico.
cuidado: O hidrato de ácido molibdatofosfórico é uma substância inflamável e corrosiva. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
cuidado: O etanol é uma substância potencialmente inflamável e perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
CUIDADO: 1-Naftol é uma substância inflamável, corrosiva e extremamente perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
cuidado: O reagente de spray azul de molibdênio é uma substância corrosiva, tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em uma capela de fluxo laminar usando equipamento de proteção individual apropriado (jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo).
