Purificação de Baculovírus Baseada em Cromatografia de Afinidade de Heparina: Uma Técnica para Isolar Baculovírus do Sobrenadante de Células de Insetos

Resumo

Fonte: Nasimuzzaman, M. et al., Produção e Purificação de Baculovírus para Aplicação em Terapia Gênica. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, demonstramos a técnica para isolar o baculovírus de um sobrenadante de célula de inseto usando cromatografia de afinidade de heparina. O isolamento é facilitado pela afinidade entre a heparina na coluna e a glicoproteína do envelope do baculovírus.

Protocolo

1. Preparação do sistema de cromatografia

1. Preparar o sistema de cromatografia enxaguando sequencialmente a amostra e as linhas de tampão, cada uma com água estéril, hidróxido de sódio 1 N, água e tampão de lavagem (tampão fosfato de sódio 20 mM contendo cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0) a um caudal linear de 50 ml/min.
2. Prepare uma coluna de heparina de 50 μm (10 × 10 cm, 7,9 mL de volume da coluna (CV)) executando sequencialmente o tampão de limpeza da coluna (tampão de fosfato de sódio estéril 5 CV 20 mM contendo cloreto de sódio 2 M, pH 7,0) e tampão de lavagem 5 CV a uma taxa de fluxo linear de 7 mL / min.

2. Purificação do vetor Baculovirus

1. Configure o sistema de cromatografia da seguinte forma:
   1. Use a porta de entrada de carregamento de amostra para carregar o sobrenadante do baculovírus.
   2. Use a porta de entrada do buffer A1 para carregar o buffer de lavagem. Prepare um frasco com pelo menos 500 mL de tampão de lavagem e coloque a linha de tampão de lavagem no frasco.
   3. Use a porta de entrada do tampão A2 para carregar o tampão de eluição (fosfato de sódio 20 mM com cloreto de sódio 1.5 M, pH 8.0). Prepare um frasco com pelo menos 500 mL de tampão de eluição e coloque a linha de tampão de eluição no frasco.
   4. Insira vários tubos cônicos de 50 mL no coletor de frações para coletar o sobrenadante do baculovírus de passagem da coluna, o tampão de lavagem e o baculovírus eluído.
2. Equilibre a coluna de heparina com cinco volumes de coluna de 7,9 mL (CVs) de tampão de lavagem (40 mL) a uma taxa de fluxo linear de 7,0 mL / min.
3. Carregue 250 mL de sobrenadante de baculovírus na coluna de heparina usando a bomba de amostra (porta de entrada da amostra) do sistema de cromatografia a uma taxa de fluxo linear de 2,0 mL / min.
4. Execute 10 CVs (80 mL) de tampão de lavagem através da coluna de heparina a uma taxa de fluxo linear de 2.0 mL / min até que a curva de absorbância ultravioleta (UV) (280 nm) retorne à linha de base e se torne estável.
5. Eluir as partículas de baculovírus da coluna de heparina de 7,9 mL com 5 CVs (40 mL) de tampão de eluição a uma taxa de fluxo linear de 4,0 mL / min. Observe um pico acentuado de eluição de proteína no cromatograma quando as partículas de baculovírus se dissociam da coluna de heparina.
6. Após a eluição, diluir imediatamente o sobrenadante de baculovírus eluído 10 vezes usando tampão fosfato de sódio 20 mM em água para evitar a inativação de partículas de baculovírus por choque osmótico durante a centrifugação subsequente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Akta Avant 150	GE Saúde	28976337	Sistema de cromatografia
POROS Heparina 50 μm Coluna	ThermoFisher Scientific	4333414	Coluna de heparina
Tampão de lavagem	Internamente	Item não catalogado	20 mmol/l tampão fosfato contendo 150 mmol/l de cloreto de sódio
Tampão de eluição	Internamente	Item não catalogado	20 mmol/l tampão fosfato contendo 1,5 mol/l de cloreto de sódio
Tubo cônico de 50 ml	ThermoFisher Scientific	14-959-49A	Para coleta de sobrenadante de Baculovirus
Buffer de limpeza de coluna	Internamente	Item não catalogado	20 mmol/l tampão fosfato contendo 2,0 mol/l de cloreto de sódio
Água estéril	Internamente	Item não catalogado	Para limpeza Akta Avant
hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	1.09137	Para limpeza Akta Avant